节杆菌AD1菌株的阿特拉津氯水解酶基因在大肠杆菌中的表达.pdfVIP

03 文章编号：0465—7942(2003)04一0120 ≯●女_女*●擎 ；研究简报l ★十*十十__# 节杆菌ADl菌株的阿特拉津氯水解酶基因 在大肠杆菌中的表达 任毅1韩宇宁2王松文3蔡宝立1 (1．南开大学、天津大学联合研究院，南开大学分子生物学研究所，天津30007l；2．北京华大基因研究中心，北京101300 3．天津农学院农学系，天津30∞81) 摘要：用PcR方法从节杆菌ADl菌株中扩增出完整的阿特拉津氯水解酶基4船A．该基因与载体pGEM—T 连接成重组质牲以后，转化大肠杆菌DH5n，袭达出了有活力的阿特拉津氯承解酶， 关键询：节杆菌ADl菌株；阿特拉津氯水解酶基因；基因表达 中圈分类号：Q786 文献标识码：A o引 言 阿特拉津是一种广泛使用的三嗪类除草荆，由于其分子中含有一个氯原子，所以具有生物毒性，其对 土壤、地下水和表面水造成的污染以及对生态环境的危害，在国内外引起广泛关注，并被确认是影响人类 健康的内分泌干扰剂．近年来，阿特拉津生物降解的分子机制、降解细菌的遗传改造和污染环境生物修复 的研究成为热点问题Ⅲ，虽然自1985年以来从污染环境中分离到多个降解阿特拉津的菌株，但是对其生 物降解的分子机制进行深入研究并在生物修复中得到成功应用的菌株，只有假单胞菌(Pse“dom—nssp．) pADP一1中，质粒的核苷酸序列为108845 津降解基因中，阿特拉津氯水解酶基因(n＆A)最为重要，它编码的阿特拉津氯水解酶(At2A)催化降解途 径的第一步反应，使有毒的阿特拉津经过水解脱氯后变成无毒的羟基阿特拉津，所以该基因的分子特性以 及在环境细菌检测和污染环境生物修复中应用的研究引起广泛重视o“]． 我们从农药厂废水中分离到高效降解阿特拉津的节杆菌(A“^r0妇“ersp．．以前曾误称为假单胞菌) ADl菌株“]，并对该菌株在污染土壤生物修复中的应用进行了研究“]．最近，我们用PcR方法从ADl菌 株中扩增出阿特拉津氯水解酶基因n“A，并测定了该基因的核甘酸序列为1425bpn：．这是第二个测定核 报道节杆菌ADl菌株的口＆A基因在大肠杆菌中的克隆和表达，这为环境中阿特拉津降解细菌的检测和 污染环境的生物修复研究奠定了基础． 1结果与讨论 l·l 萝杆菌ADl菌株的4垃A基因与质粒载体pGEM—T的重组 我们以假单胞菌ADP菌株4＆A基因的两端序列为参考，设计扩增该基因的PcR引物，以节杆菌 ADl菌株的总DNA为模板．扩增出了ADl菌株的n据A基因及其启动子和核糖体结合位点序列，大小为 收藕日期：2003一04一05 基金项目：教育部南开大学、天津大学科技合作基金资助项目 作者稿介：任毅(1977一)，男，河北石家庄人，硕士研究生． 万方数据 第4期 任 毅等：节杆菌ADl菌株的阿特拉津氯水解酶基因在大肠杆菌中的表达 ·121· 析，得到含有口＆A基因的大肠杆菌”】．因为1551bp片段可能以两种不同的方向插入T载体，所以我们通 过限制酶分析选出一个在重粒中nfzA基因的起始端与载体的如cz启动子连接的菌落，即正向连接重组 菌t用于基因表达分析．由于基因的5 7末端含有1个EcoRI位点，3 7末端含有1个H抽dⅢ位点(上述2个 位点由PcR引物携带)，载体连接位点(T)的两侧多克隆位点各含有1个EcoRI位点。nf：^基因的 959bp处和连接点的上游多克隆位点各含有1个尸“1位点，所以用Hz”dⅢ和E∞R I双酶消化正向或反 的2个片段．图1是正向连接的重组质粒限制酶消化片段的琼脂糖凝胶电泳图，该重组质粒命名为 pADlA．用于基因表达分析． 圈l 重组质粒pADlA的限制酶分析 1 Res”舵tioⅡ舳aIys拓0f Fjg