SiRNA和RNAi的实验技术手册.pdfVIP

（技术部整理编辑） SiRNA与RNAi实验技术手册 RNA 是生物体内最重要的物质基础之一，它与 DNA 和蛋白质一起构成生命的框架，但长 久以来，RNA 分子一直被认为是小角色。然而，一系列发现表明——这些小分子 RNA 事实上 操纵着许多细胞功能。它可通过互补序列的结合反作用于 DNA，从而关闭或调节基因的表达。 甚至某些小分子 RNA 可以通过指导基因的开关来调控细胞的发育时钟。RNA 干涉 （RNAi）是 在线虫中发现的，在 1998 年的一篇 Nature 论文中被公诸于众。 此后，科学家们还明白， RNAi 还有其他形式，它既是一种了解基因功能的强大工具，又是很多生物的基因组所采用 的一种在演化上来讲很古老的防卫方法。 一、什么是 siRNA 和 RNAi？ 双链 RNA 经酶切后会形成很多小片段，称为 siRNA，这些小片段一旦与信使 RNA(mRNA) 中的同源序列互补结合，会导致 mRNA 失去功能，即不能翻译产生蛋白质，也就是使基因 “沉 默”了，双链 RNA 对基因表达的阻断作用就被称为RNA 干预（RNA interference, RNAi ）。 二、RNAi 的作用机制是什么？ 目前 RNAi 的作用机理主要是在线虫，果蝇，斑马鱼等生物体内阐明的。生物体内的双 链 RNA 可来 自于RNA 病毒感染、转座子的转录产物、外源导入的基因。这些来源的双链 RNA 诱发了细胞内的 RNAi 机制，结果是病毒被清除、转座子的表达被阻断、外源导入基因表达 被阻断，同时与其同源的细胞基因组中的基因表达也被阻断。 通过生化和遗传学研究表明，RNA 干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。 A、在起始阶段，加入的小分子 RNA 被切割为 21-23 核苷酸长的小分子干扰 RNA 片段 (small interfering RNAs, siRNAs)。证据表明；一个称为 Dicer 的酶，是 RNase III 家族 中特异识别双链RNA 的一员，它能以一种 ATP 依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因 病毒感染等各种方式引入的双链 RNA，切割将 RNA 降解为 19-21bp 的双链 RNAs(siRNAs)，每 个片段的 3’端都有 2 个碱基突出。 热线电话：021 －6485 8053 8009881995 E-mail:master@ 网址： （技术部整理编辑） B、在 RNAi 效应阶段，siRNA 双链结合一个核酶复合物从而形成所谓 RNA 诱导沉默复合 物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活 RISC 需要一个 ATP 依赖的将小分子 RNA 解双链的过程。激活的 RISC 通过碱基配对定位到同源 mRNA 转录本上，并在距离 siRNA3’ 端 12 个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个 RISC 都包含一个 siRNA 和一个不同于 Dicer 的RNA 酶。 另外，还有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt长的片段, 这种 dsRNA 可使内源相应的 DNA 序列甲基化,从而使启动子失去功能,使其下游基因沉默. 三、如何进行 RNAi 试验的设计？ RNAi 研究的一般技术路线一般如下： 由上述的路线可以看出，获得高纯度的siRNA产物是进行实验的第一步，而转染的 效率则是非常关键的因素。 A、设计siRNA序列 1、 在设计RNAi实验时，可以先在以下网站进行目标序列的筛选 /business/products/order2.htm 热线电话：021 －6485 8053 8009881995 E-mail:master@ 网址： （技术部整理编辑）