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EST序列分析方法介绍 徐昊 Fry9527@ • 分析EST序列的目的 • 获得EST序列的方法 • 分析EST序列的方法 • 如何提交EST序列 分析EST序列的目的 • 基因识别 • 获得全长cDNA • 研究基因可变剪接类型 • SNP的发现 • 表达量比较 • 分析EST序列的目的 • 获得EST序列的方法 • 分析EST序列的方法 • 如何提交EST序列 如何获得EST序列 • 从数据库下载 - dbEST /dbEST/ - CGAP / - UniGene /UniGene/ - Tigr Gene Index /tdb/tgi/ • cDNA文库测序 dbEST CGAP UniGene EST序列测序 cDNA文库构建 • 基本原理 • 文库类型 - 非标准化cDNA文库 - 标准化cDNA文库 - 差减cDNA文库 - 抑制性差减cDNA文库 • 文库测序 - 单向测序 - 双向测序 基本原理 cDNA 文库是指某生物某发育时期所转 录的全部mRNA 经反转录形成的cDNA 片 段与某种载体连接而形成的克隆的集合。 经典cDNA 文库构建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引 物，给所合成的cDNA 加上适当的连接接 头，连接到适当的载体中获得文库。 提取Total RNA 分离mRNA cDNA双链合成 制备载体 cDNA和载体连接 电转化流程 cDNA库扩增 均一化cDNA文库 • 它是指某一特定组织或细胞的所有表达基 因均包含其中，且在cDNA 文库中表达基 因对应的cDNA 的拷贝数相等或接近。 • 构建方法 - 基于复性动力学的原理，高丰度的cDNA 在退火条件下 复性的速度快，而低丰度的cDNA 复性要很长时间 - 基于基因组DNA 在拷贝数上具有相对均一化的性质，通 过cDNA 与基因组DNA 饱和杂交而降低在文库中高拷贝 存在的cDNA 的丰度。 差减cDNA文库 • mRNA 减法杂交 （mRNA-SH) Duguid JR, et al. PNAS 1988; 85: 5738- 5742; Sive HL and John ST. Nucleic Acid Res 1988; 16: 10937- 10938） 实验组mRNA 对照组mRNA ↓ ↓ 反转录为单链cDNA （量少） 生物素标记mRNA （量多） ↓杂交(约1:20) 生物素标记mRNA：cDNA杂合子 ↓与链球菌抗生物素蛋白进行交联反应 生物素标记mRNA：cDNA杂合子 交联于链球菌抗生物素蛋白上 ↓ 去双链结构