柯里拉京对氧化应激损伤SH-SY5Y和N9细胞保护作用及机制研究.pdfVIP

中文摘要 柯里拉京对氧化应激诱导SH—SYSY、N9细胞损伤的保护作用及其机制研究 近年来，氧化应激被认为是引起衰老和神经退行性疾病的主要原因，其中活性 氧在神经退行性疾病的发病过程中扮演着举足轻重的角色：脑组织的氧化代谢率很 高，神经元膜上含有大量的多不饱和脂肪酸等氧化底物；过氧化氢酶活性低，铁离 子结合力低，比其他部位更容易受到氧化作用的影响，最易受到活性氧侵袭损害。 研究表明，炎症也可以引发神经细胞死亡，从而形成恶性循环，加速病情的恶 化。参与炎症介导的神经退行性病变的几种细胞中，巨噬细胞样细胞-d,胶质细胞 是最重要的一种。氧化应激是导致神经退行性疾病的主要原因，而小胶质细胞正是 产生氧化应激的最主要来源；越来越多的证据表明氧化应激诱导小胶质细胞的损伤 优先激发神经元的损伤。小胶质细胞过度激活所释放的大量NO、TNF．仅等促炎症 细胞因子和ROS等神经毒性因子，会对神经元产生毒性作用，导致神经元的变性 和死亡，进而导致AD、PD等神经退行性疾病的发生。 因此，通过增加细胞抗氧化能力、阻断或抑制氧化应激引起的神经元和神经胶 质细胞损伤以及抑制小胶质细胞异常激活都可能成为神经退行性疾病的防治策略。 致力于寻找新的抗氧化、抗炎药物以减轻氧化损伤和炎症反应，延缓病情发展将成 为神经退行性疾病治疗的新的着眼点。 研究发现许多化学合成物质如多酚类，具有很强的清除自由基能力，但常有一 些严重副作用，因此找寻可以清除自由基和对细胞氧化损伤有保护作用，具有神经 保护潜能的天然物质也已成为学者新近关注的热点。 柯里拉京，又称云实精，是一种天然多酚类单宁酸化合物，易溶于MeOH、EtOH、 Aceton、DMSO，在冷水中溶解度小，是叶下珠、老鹳草、蜜柑草、白三草等植物 中的有效成分，也存在于余甘子、龙眼、橄榄等具有抗氧化、抗衰老功效的植物果 实中。柯里拉京具有抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗纤溶、降血压、抗肿瘤、抑制病 毒、抗菌、抗炎等广泛的生物学活性。但迄今为止，国内外对其的药理作用研究多 集中在其抗肿瘤、抗菌和心血管保护等方面，且多为提取组份，而对神经保护作用 方面却未见报道，值得我们进行探讨。 1目的 6 本课题应用人神经母细胞瘤株(SH．SY5Y细胞)和鼠小胶质细胞(N9细胞)， 建立氧化应激损伤的体外细胞模型，探讨柯罩拉京单体的神经保护作用潜能。以叔 丁基过氧化氢诱导损伤细胞，研究柯罩拉京对这两种细胞的保护作用，观察其对细 胞抗氧化功能和自由基的影响；观察柯里拉京对叔丁基过氧化氢诱导SH．SY5Y和 N9细胞凋亡的抑制作用；观察柯罩拉京对N9细胞过度激活引起的炎症抑制作用： 并对相关作用机制进行探讨，为神经退行性病变的防治和新药开发提供可靠的实验 依据。 2方法 本课题首先应用SRB法检测柯里拉京本身的细胞毒性：通过MTT法检测细胞 活性建立了叔丁基过氧化氢诱导细胞氧化应激损伤的体外模型；通过观察细胞形态 学的变化以及MTT法和LDH释放法检测细胞损伤程度考察了柯罩拉京非药物毒性 剂量下预处理对体外细胞氧化应激损伤的保护作用。 通过荧光探针标记，以荧光显微镜观察细胞内活性氧变化，以激光共聚焦和流 式细胞技术观察细胞线粒体膜电位变化；通过生化比色法检测细胞总抗氧化能力 T．AOC、抗氧化酶SOD活力，脂质过氧化等，探讨柯里拉京抗氧化特性在对叔丁 基过氧化氢诱导细胞氧化应激损伤保护作用中的作用。 通过AO／EB染色法观察细胞形态、琼脂糖凝胶电泳分析细胞DNA片段化和流 式细胞术分析细胞凋亡峰；通过酶活性检测、免疫印迹法等分析细胞凋亡相关信号 分子的表达，探讨柯里拉京抗细胞凋亡作用及其可能机制。 测炎症相关因子TNF．0【；实时荧光PCR法相对定量分析细胞iNOSmRNA基因的表 达；以荧光免疫法细胞原位检测NF．KB激活核转录等，探讨柯罩拉京的抗炎特性及 其在抗N9细胞过度激活引起炎性反应的抑制作用。 课题定量结果以均值±标准差(；±。)表示；组问均数比较采用单因素方差分 析和卜检验法，P0．05为差异显著。 3结果 (1)保护作用柯里拉京在高浓度范围对SH．SY5Y和N9细胞具有一定的细 h、48h 胞毒作用，24 7．64(1aM)；