PCR反应体系中各种成分的作用.pdfVIP

PCR 反应体系中各种成分的作用 不同模板浓度的实验结果 用相同的引物、两种不同的模板,对6 种不同模板量进行ＰＣＲ 扩增,发现在模板量25 ｎｇ的条件下,扩增产物强度相应减弱,大约 到2 ｎｇ左右时无扩增产物;当模板量在25 ｎｇ～200 ｎｇ之间时,扩 增产物基本稳定,条带清晰、稳定,分辨率高;当模板量200 ｎｇ时, 会出现大片段扩增产物的缺失或无扩增产物,且点样孔至泳道会出现 相应增强的弥散背景。综合考虑,在 25μ ｌ的ＰＣＲ反应体系中,模 板ＤＮＡ以25～100ｎｇ为最适用量。同时模板ＤＮＡ在200 ｎｇ以 下不影响扩增结果,但为降低ＴＥ缓冲液中ＥＤＴＡ对反应体系中Ｍ ｇ2+的不良影响程度,应该尽量降低ＤＮＡ模板用量。 不同Ｍｇ2+浓度时实验结果 设置不同Ｍｇ2+浓度,当Ｍｇ2+浓度为1 0ｍＭ时,无ＰＣＲ扩增 产物;Ｍｇ2+浓度为 1 5～2 5ｍＭ时,随着Ｍｇ2+浓度的增加, ＰＣＲ 扩增产物带型基本一致,但以2 0ｍＭ的扩增效果最好 不同引物浓度对ＰＣＲ结果的影响 设置5 种不同浓度的引物进行ＰＣＲ扩增,当引物浓度在0 1～0 2μ Ｍ时,扩增结果基本一致;但随着引物浓度的逐渐增加,开始出现 弥散背景增强的趋势,并且有些扩增带发生减弱或缺失。为了保证反 应结果的稳定性和特异性,引物浓度以0 .2μ Ｍ左右为宜。 不同ｄＮＴＰ浓度对ＰＣＲ结果的影响 采用2 种引物(ＯＰＢ17、ＯＰＡ16),分别以4 种不同的ｄＮＴ Ｐ浓度进行ＰＣＲ反应,发现ｄＮＴＰ浓度在100μ Ｍ、150μ Ｍ、200 μ Ｍ、300μ Ｍ时,随着浓度的减小,扩增带明显减少或扩增强度减弱, 当ｄＮＴＰ浓度200μ Ｍ时,扩增产物丰富、清晰、带浓,扩增片段产 率与ｄＮＴＰ浓度呈正相关。综合考虑,以100～200μ Ｍ的ｄＮＴＰ 浓度为佳。 ＴａｑＤＮＡ聚合酶对扩增结果的影响 设置5 个梯度的ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度,结果表明随着Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶浓度的增高,扩增产物量呈增多趋势。在0 5 ｕ～2 5 ｕ 浓度间均有扩增产物,但随着ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度增加的同时, 弥散背景也相应增强。综合考虑,ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度以1 0～1 5 ｕ结果较好 不同退火温度下的扩增效果 引物用ＯＰＤ16和ＯＰＡ01,按照优化的ＰＣＲ反应体系将退火 温度分别设置为 33℃、36℃、39℃、42℃。结果表明随着退火温度 降低,非特异性产物增加,有弥散背景;退火温度升高,特异性相对增 加。 Ｍｇｃｌ2 与ｄＮＴＰ互相作用及对ＰＣＲ反应的影响 用 同一引物ＯＰＤ07、相同模板ＤＮＡ比较3 种Ｍｇ Ｃｌ2 浓度与 3 种ｄＮＴＰ浓度完全随机相结合的9 个处理的ＰＣＲ结果,研究了Ｍ ｇｃｌ2 与ｄＮＴＰ的相互作用。结果表明,Ｍｇｃｌ2 在低浓度时, 过量的ｄＮＴＰ对Ｍｇ2+的螯合作用明显,表现为降低Ｍｇ2+的酶催 作用, ＰＣＲ扩增产物减少或无,而低量的ｄＮＴＰ对Ｍｇ2+酶催的 抑制作用减少, ＰＣＲ扩增产物增多。在高浓度Ｍｇｃｌ2 浓度下, ｄ ＮＴＰ无抑制作用。在相同Ｍｇ2+离子浓度和足量ｄＮＴＰ时,扩增 产物相似。1-9 泳道分别代表Ｍｇｃｌ2(ｍＭ)/ ｄＮＴＰ(μ Ｍ)的浓 度(1/100、1/200、1/300、2/100、2/200、2/300、3/100、3/200、 3/300)。 PCR 反应体系与反应条件 标准的PCR 反应体系： 10×扩增缓冲液 10ul 4 种dNTP 混合物 各200umol/L 引物 各10～100pmol 模板DNA 0.1～2ug Taq DNA 聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul PCR 反应五要素：参加PCR 反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、 模板和Mg2+ 引物： 引物是PCR 特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决 于引物与模板DNA 互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA 序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR