一种新型钙调素结合蛋白-金属蛋白酶在龙须菜高温胁迫中的表达模式的研究.pdfVIP

谨以此论文献给给予我无私支持的父母，对我严格要求的 导师和长期帮助我的同学 ——龚乐 万方数据 万方数据 万方数据 一种新型钙调素结合蛋白-金属蛋白酶在龙须菜高温胁迫中的表 达模式研究 摘 要 龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)是一种重要的产琼胶经济海藻，原产于山东和辽 宁，在我国已成为继海带和紫菜后的第三大栽培海藻。随着龙须菜栽培业的不断发展， 对龙须菜种质提出了更高的要求，研究者们先后选育出耐热品种981 和07-2 ，使得龙须 菜品质得到了不断改良，其耐高温性能也不断提高，带来了巨大的经济效益和社会生态 效益。然而，在龙须菜大规模栽培中，这两个耐高温品系也出现了种质退化现象，为此， 迫切需要研究龙须菜在高温胁迫下的响应机制，为选育性状优良、耐高温性强的龙须菜 新品系奠定基础。 实验室前期通过酵母双杂交系统筛选高温胁迫条件下钙调素（CaM ）结合蛋白，得 到了金属蛋白酶（metalloproteinase of Gracilaria lemaneiformis , GlMP ）的表达序列标签， 表明金属蛋白酶可能是龙须菜CaM 信号传导途径中的一员，在龙须菜响应高温胁迫中 发挥作用。本论文在此基础上，首次克隆龙须菜的GlMP 基因，并研究其在高温胁迫下 的表达模式，为探讨龙须菜对高温胁迫下的信号传导途径打下基础，并为龙须菜耐高温 品系的选育提供可用的基因信息。 本研究以野生型、981 和07-2 三种龙须菜为实验材料，通过RACE 技术和Genome Walking 方法，首次克隆了龙须菜中GlMP 基因的cDNA 和DNA 序列全长。结果表明， 克隆得到的龙须菜GlMP cDNA 全长546bp ，包括462bp 的开放阅读框，36bp 的5’ UTR 以及48bp 的3’ UTR 。开放阅读框编码153 个氨基酸，其中包括金属蛋白酶的Zn2+保守 结构域HEXXH 。克隆得到的龙须菜GlMP 基因全长1123bp ，其中包含5’端侧翼序列 542bp，以及一个长约71bp 的内含子。比较发现野生型、981 和07-2 三种龙须菜中GlMP 的序列无差异。Southern 杂交结果表明无论是野生型、981 还是07-2 ，基因组中均含有 2 个拷贝GlMP 基因。利用酵母双杂交技术检测表明，GlMP 可以与CaM 相互作用，是 一种钙调素结合蛋白。 通过比较3 种龙须菜中GlMP 和CaM 的表达水平发现，野生型龙须菜中GlMP 的 表达水平高于981 和07-2 龙须菜，981 龙须菜中CaM 的表达高于其余2 种品系，而3 种龙须菜的耐高温性能是07-2981野生型，可见耐高温性能并不是由单一因子表达水 平决定的，可能与多种耐高温因子及它们之间的协同作用有关。龙须菜中GlMP 和CaM 万方数据 均在32°C 表达高于28°C，表明它们都可以对高温胁迫积极响应。 此外，本论文以CaM 为诱饵，通过酵母双杂交筛选到39 条CaM 结合蛋白的基因， 经生物信息学分析发现，这些基因多为蛋白酶类，参与各种水解、氧化还原、脱羧等反 应，并且其蛋白质的二级结构符合钙调素结合域（CaMBD ）的特点。根据钙调素结合 蛋白（CaMBP ）数据库分析本研究获得的GlMP 氨基酸序列，发现其82-123 位具有 CaMBD 结构域的特点，推测为钙调素结合区域，为了验证该区域，本研究将GlMP 的 氨基酸序列分为4 部分-CaMBD 部分（表示为Most ），CaMBD 上游部分（表示为Front ）， CaMBD 下游部分（表示为Last ）和全长GlMP （表示为Whole ），分别将这四部分与 CaM 采用酵母双杂交进行验证，结果显示Most 和Whole 部分菌落变蓝，而Front 和Last 部分没有变蓝，表明软件预测的GlMP 中82-123 位的氨基酸区域是CaMBD，GlMP 是 一种钙调素结合蛋白。