盐生杜氏藻光系统Ⅱ主要捕光叶绿素a%2fb结合蛋白基因的克隆与表达及研究.pdf

砰Ⅲ大学硕士孝位论文 盐生杜氏藻光系统II主要捕光 叶绿素a／b结合蛋白基因的克隆与表达研究 微生物学专业 研究生魏亮 指导教师乔代蓉 在高等植物和藻类中，光系统II的外周天线含有大量的主要光捕获复合 物(LHCⅡ)和少量的次要光捕获复合物(minorL}IC)。这些光捕获复合物 是由捕光叶绿素a／b结合蛋白以及相应的色素组成的。LHCⅡ蛋白是光系统 Ⅱ的主要捕光叶绿素a／b结合蛋白，由Lhcb基因家族编码。LHCII蛋白数量 众多，彼此之间有着很高的同源性。LHCll是类囊体膜上重要的色素结合物， 其含量占了类囊体膜蛋白总量的1／3以上，并且结合了50％以上的叶绿素。 LHCⅡ的主要功能是光能的吸收和传递，提高捕光面积和捕光效率；此外， LHCH在光能分配的调节以及光保护过程中也具有重要的作用。 在高等植物中，LHCII蛋白被广泛的研究。藻类中的LHCII蛋自在数量 和复杂性上与高等植物中的相类似。然而除了衣藻外，藻类中LHCII蛋白基 因的组成和分类相关信息却十分缺乏。 盐生杜氏藻(Dunaliellasalina)是一种光合自养型的单细胞绿藻，其有着 极强的耐盐性和耐强光能力。在极端条件下盐藻是研究每个LHCII蛋白功能 差异的有用模型。高光会导致植物受到损伤，高等植物和藻类能通过多种途 径来减少这种损伤。光捕获复合物的负调控就是一种有效的光保护途径。 LHCII蛋白基因在转录水平上的调控，对于捕光天线大小的改变至关重要。 只有在盐藻中鉴定出完整的LHCII蛋白基因，才能在分子水平上明确这种机 制。本文在已经构建了盐藻cDNA文库的基础上，开展了以下内容的研究： 一、4条肋c日基因cDNA全长的克隆。通过制备同源探针，在盐藻的 四川大学项士擘住论文 蛋白的基因至少有5条。借鉴衣藻中的命名方法，本文首次对已克隆到的5 DsLhcll-2．2，DsLhcll-3，i曰DsLhcII-4(本文报道)。 二、基因序列内含子-夕}显子结构的分析。根据4条cDNA各自的3’和5’ 非翻译区设计出特异引物，从基因组中扩增了其相应的DNA序列，分析其 内含子-夕}显子结构。发现盐藻的4条新的LhcII基因含有5—7个内含子， 度等都十分相似，并且两者的内含子在序列组成上也基本相同。但其5UTR 和3UTR序列却完全不同，说明这是两条基因。通过对其内含子的分析，可 以推测这两条基因很可能是在分子进化中复制而来的。 三、完成了盐藻5条Lhcll基因的生物信息学分析。对5条基因及其推 演出的蛋白质序列进行了相关的生物信息学分析，发现了盐藻LHCII蛋白的 一些的独特性质。例如DsLhcll．2这一类蛋白很可能在杜氏属的其它藻种中 普遍存在，以及盐藻LHCII蛋白在转运肽的形成上可能存在着差异。通过构 建无根树发现盐生杜氏藻的LHCII蛋白不能归为高等植物LHCII蛋白的任何 一类，也不能归为衣藻的LHCII蛋白中去，因此其在进化地位上具有独立性 的特征。 四、完成了眦^dz0基因受光诱导的mRNA转录水平差异的研究。通 过荧光定量PCR的方法，进行该基因的差异表达研究。实验结果表明高光 照射和暗环境培养都会降低该基因的mRNA水平．但在高光和暗环境条件 下，n妃^出3基因的mRNA水平是在不同的时间发生变化的，这可能预示 着其在转录调控机制上的差异。该研究内容为今后开展盐生杜氏藻肌c6基 因家族的差异表达奠定了基础。 q ● 』 完整ORF序列设计引物，克隆得到该基因ORF全长，实现了其在大肠杆菌 ‘． 中高效表达。为今后抗体的制备和体外色素结合实验等研究奠定了基础。 关键词盐生杜氏藻 光系统Ⅱ