考马斯亮蓝法测定蛋白质含量.pptVIP

实验三 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 一.目的: 掌握考马斯亮蓝G－250染色法测定蛋白质的原理和操作；了解分光光度法测定蛋白质的几种方法；进一步熟悉分光光度计的使用。 二、原理分光光度法测定蛋白质的几种方法 1、双缩脲法：在碱性条件下，蛋白质能与铜离子结合形成紫红色络合物，540nm，1-10g/L。与蛋白质的相对分子量及氨基酸组成无关，快速，不受硫酸铵干扰。灵敏度低，需要样品量大； 2、Folin-酚试剂法（Lowry法）：在碱性条件下，蛋白质首先与铜离子形成紫红色络合物，该络合物以及Tyr，Trp残基还原Folin试剂，产生深蓝色。750nm，0.03-3g/L或500nm，0.05-0.5g/L。灵敏度高，需要样品量少；但干扰因素多，操作试剂配制麻烦，不同蛋白质之间差异大。 3、考马斯亮蓝染色法：在酸性环境下，棕红色的考马斯亮蓝与蛋白质通过疏水力相结合，蓝色化合物，595nm，颜色深浅与蛋白质含量成正比。 0.01-1g/L，灵敏度高，需要样品量少，不同蛋白质之间差异大。 4、紫外分光光度法：280nm，不同蛋白质之间差异大 三、仪器 721分光光度计（使用前预热20min）； 移液管： 四、实验试剂 标准蛋白质溶液：用牛血清白蛋白配成含蛋白质0.1mg/mL的标准蛋白溶液； 染色液（考马斯亮蓝G－250溶液）：称取0.1mg考马斯亮蓝G－250，溶于50 mL 90％乙醇中，加入85％的磷酸100 mL ，蒸馏水定容到1000 mL ，贮放在棕色瓶中，此溶液在常温下可放置1个月。 待测蛋白质溶液 五. 实验操作 1、标准曲线(蛋白质含量为0～0.1mg/mL)的绘制: 利用1，2，3，4，5，6号试管数据绘制。1号试管调零。 2 、样品提取液中蛋白质浓度的测定 7，8好试管数据取平均值。　 试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 蛋白质标准溶液（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0 0 蒸馏水（ml） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 0 待测蛋白质溶液（ml） 0 0 0 0 0 0 1.0 1.0 蛋白质含量(?g) 0 20 40 60 80 100 未知 未知 考马斯亮蓝溶液（ml） 5 5 5 5 5 5 5 5 混合，放置5min后，用1cm光径比色杯在595nm下比色，测得A 595nm 。 以蛋白质浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。 调0 注意事项: 思考题 比较该法与其他几种常用蛋白质的定量测定方法。