白扁豆多糖对体外培养的胎鼠大脑皮层神经细胞缺氧性凋亡的保护性和研究.pdf

IIIIII tllll Itll ll Il lUl ＼1 摘要 摘要 目的：通过研究补气类中药白扁豆多糖对体外培养的胎鼠大脑皮层神经细 胞缺氧诱导的凋亡的保护机制，进而为临床使用白扁豆多糖防治脑中风及缺血／ 缺氧性脑病等疾病提供理论依据。 Supplement进行神经细胞体外无血清培养； 2．通过神经元特异性烯醇化酶(neuronspecificenolase，NSE)及胶质纤维酸 acid 性蛋I刍(glialfibrillary 学法染色，观察神经元细胞及神经胶质细胞的比例； 3．采用MTT法观察白扁豆多糖对培养4d的神经细胞作用48h后的毒性作 用，初步筛选出白扁豆多糖抗神经细胞缺氧损伤的浓度范围； blue拒染法检测神经细胞活力，观察缺氧时间与神经细胞存 4．通过Trypan 活率间的关系，判断最适缺氧时间； 5名申经细胞正常培养4d后，加入终浓度为O～Smg／ml白扁豆多糖预处理2h， 再缺氧12h复氧培养48h后，行MTT测定，观察白扁豆多糖抗神经细胞缺氧性 损伤作用，筛选出白扁豆多糖抗神经细胞凋亡实验的药物浓度； 6．白扁豆多糖抗神经细胞凋亡实验分组：(1)正常对照组：即在37℃、5％C02、 饱和湿度的培养箱中培养；(2)凋亡诱导组：神经细胞常规培养4d，再缺氧12h， 的白扁豆多糖预处理2h，再缺氧12h，复氧培养48h； 7．通过AnnexinV-FITC染色流式细胞术测定神经细胞凋亡率和坏死率； 8．采用DNA琼脂糖凝胶电泳法检测各组凋亡的神经细胞DNA条带； 达率的变化。 结果：1．胎鼠大脑皮层神经细胞体外无血清培养6d后，神经元约占(92．5 ±2．20)％，神经胶质细胞约为(7．24+1．15)％； 2．白扁豆多糖浓度为1．0mg／ml～6．Omg／ml时有促进神经细胞增殖作用，且呈 剂量依赖性，细胞相对增殖率由3．53％升高至28．94％。与正常对照组比较，浓 摘要 时，白扁豆多糖对神经细胞增殖率几乎无影响，而浓度为16．Omg／ml时则有明显 的毒性作用，对神经细胞有抑制作用，细胞相对增殖率为．24．16％。 相比，12h、24h有显著性差异妒0．001)，而6h无统计学差异俨0．05)。 4．O．5mg／ml-8．Omg／ml的白扁豆多糖具有抗神经细胞缺氧性增殖抑制作用， 与阳性对照组相比，神经细胞相对增殖率由0提高至59．58％，差异明显(均有尸 0．001)；与正常对照组比较，神经细胞相对增殖率由65．04％提高至103．79％。 为明显。而当白扁豆多糖浓度低于0．5mg／ml或高于6．0mg／ml时，虽然存在抗神 经细胞缺氧性增殖抑制作用(与阳性对照组比较尸o．001)，但作用明显下降(与 正常组比较P0．01)。 有显著性差异(Po．05)；白扁豆多糖三个浓度组的早期凋亡率分别为 具有较强的抗神经细胞缺氧诱导的坏死作用，但效果不十分显著，与凋亡诱导 组比较均有P0．01，与正常对照组比较均有P0．05。 6．DNA琼脂糖凝胶电泳发现凋亡诱导组和白扁豆多糖0．5mg／ml组、 8．0mg／ml组可见有明显的凋亡梯状条带，而正常对照组、白扁豆多糖3．5mg／ml 组未见有明显凋亡梯状条带。 ((35．75+3．08)％)比较均有显著性差异(P0．01)。 II 摘要 3．5mg／ml组无显著性差异(PO．05)。 9．Bax免疫细胞化学结果显示，白扁豆多糖0．5mg／ml组、3．5mg／ml组、 异(尸0．05)。 结论：本研究采用多种不同的方法研究了白扁豆多糖对体外培养的胚鼠大 脑皮层神经元缺氧性坏死和凋亡的保护作用，结果发现： 1．白扁豆多糖浓度低于8．0mg／ml时对体外无血清培养的胎鼠大脑皮层神 经细胞无明显毒性作用；1．0mg／ml--6．0mg／ml时均有抗体外培养的胎鼠大脑皮层 神经细胞缺氧性增殖抑制作用。 2．白扁豆多糖浓度在0