食品中动物性成分检验方法吴郭鱼成分之定性检验.pdfVIP

食品中动物性成分检验方法－吴郭鱼成分之定性检验 1. 适用范围：本检验方法适用于食品中吴郭鱼之组织或其制品之定性检验。 2. 检验方法：聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）方法及即时 聚合酶链反应（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）方法。 2.1. 工作环境：工作平台需宽敞、洁净、光线良好。检体前处理、检体DNA 抽取、PCR试剂配制及PCR等实验过程皆需有区隔空间，避免交叉污染。PCR试 剂之配制应于无菌操作台内进行。 2.2. 装置 （注1） 2.2.1. 分光光度计：具波长260 nm、280 nm。 2.2.2. 旋涡混合器（Vortex mixer）。 2.2.3. 真空干燥装置：供DNA干燥用。 2.2.4. 真空冷冻干燥装置：温度可达-40℃以下，真空度可达133 mBar以下， 供检体干燥用。 2.2.5. 加热振荡器：具55℃温控及振荡功能。 2.2.6. 微量冷冻离心机：可达20,000 × g，并具4℃温控功能。 2.2.7. 离心机：供各式微量离心管离心用。 2.2.8. 聚合酶链反应器：ABI PRISM 9700 Sequence Detector，或同级品。 （注2） 2.2.9. 即时聚合酶链反应器 ：ABI PRISM 7700 Sequence Detector或Roche LightCycler，或同级品。 2.2.10. 电泳槽：供DNA电泳用。 2.2.11. 振荡型粉碎机：Retsch MM200，或同级品。 2.2.12. 照相装置：供拍摄电泳胶片用。 2.2.13. 紫外灯箱：具波长312 nm、365 nm紫外灯。 2.2.14. 冷冻设备：具冷藏及冻结功能。 2.2.15. 高压灭菌釜。 2.2.16. pH测定仪。 2.2.17. 水浴装置：温差±1℃以内者。 2.2.18. 天平：最大秤重量为2,000 g，灵敏度为0.1 g；最大秤重量为100 g， 灵敏度为1 mg。 2.2.19. 无菌操作台。 注１：本方法所使用或提及之产品品牌不代表为同类产品中最好者；反之，未使 用或提及之产品品牌亦不代表为同类产品中较差者。 注２：确认试验用。 2.3.试药 2.3.1. DNA抽取用：RNase、乙醇（96-100%）均采分子生物分析级试药，DNeasy　 Blood Tissue套组。 2.3.2. PCR用 2.3.2.1.鉴别试验用引子（注3） 2.3.2.1.1.鱼类（标的基因：16S ribosomal RNA，供作内部对照基因） 引子F：FishF, 5 -CGCAAGGGAAAGCTGAAAGAGA-3 引子R：FishR, 5 -TCGGTAGGTTTGTCACCTCTACTC-3 PCR增幅产物大小234 bp 2.3.2.1.2. 吴郭鱼（标的基因：Cytochrome B） 引子F：TILAF, 5 -CGCYATYCTACGCTCAATTCCTAA-3 引子R：TILAR, 5 -CCAATTCARGTRAGAATGGCG-3 PCR增幅产物大小183 bp 2.3.2.2. 确认试验用引子及探针（注4） 2.3.2.2.1. 鱼类（标的基因：16S ribosomal RNA，供作内部对照基因） 引子F：FishF, 5 -CGCAAGGGAAAGCTGAAAGAGA-3