MP65和Sap2重组表达质粒对小鼠系统性白色念珠菌感染免疫的保护作用及.pdfVIP

中文摘要 MP65和Sap2重组表达质粒对小鼠系统性白色念珠菌 感染的免疫保护作用研究 摘 要 目的：白色念珠菌(Candida 件致病菌之一， 近二三十年来己成为医院内感染(如手术创 伤，器官移植和肿瘤治疗等免疫抑制剂、广谱抗生素应用) 和免疫力低下患者(原发和继发免疫缺陷病，如AIDS)最重要 的感染病原之一，系统性感染死亡率为40‰50％。尽管目 前有新的抗真菌药物在应用，但是由于它们抗真菌谱窄，出 现新的耐药性，并没有降低白色念珠菌感染的发生率和死亡 率。因此研究安全有效的免疫制剂会为真菌感染的预防和治 疗提供新的途径，其中真菌疫苗的研究引人瞩目。 甘露聚糖一甘露糖蛋白交联物是白色念珠菌细胞壁的重 要组成成分，也是重要的粘附素分子，甘露糖蛋白65(65．kD 甘露糖蛋白成分，分子量约65kD，具有很好的免疫原性， 其中蛋白核心部分能诱导T细胞应答，对多种念珠菌感染有 acid 保护作用。分泌性酸性蛋白酶2(secretoryproteinase， Sap2)是白色念珠菌分泌产生的一种最重要的胞外蛋白酶， 与白色念珠菌营养作用、粘附、侵袭和破坏组织屏障密切相 关，是白色念珠菌致病的重要毒力因子。Sap2是大多数白色 念珠菌广泛存在的一种抗原，以可溶性抗原形式存在于血清 中，念珠菌病人的血清中存在高滴度的抗Sap2的抗体。研 究表明以Sap2的白色念珠菌提取物免疫小鼠，可以减弱该 菌对粘膜的感染。 中文摘要 因此本研究选取编码MP65、Sap2蛋白的基因，构建其 真核表达质粒及原核表达质粒，以真核质粒免疫小鼠，分析 系统性感染中的免疫保护作用，为进一步研究该蛋白功能及 研制其真菌疫苗提供实验基础。 方法：1．原核、真核表达质粒的构建：热酚法提取白 8．T载体上进行测序，测序结果正确 的基因，克隆至pMDl I、EcoR 后，经BamH I和EcoRI、ⅫoI酶切再次鉴定，最 表达质粒pcDNA3．1中。 2．目的蛋白的表达、纯化与鉴定：将重组原核表达质 酶(IPTG)诱导、超声裂解菌体、SDS．PAGE电泳观察结果， 获得重组表达的包涵体蛋白。低浓度尿素梯度透析与金属镍 螯合层析柱纯化回收重组蛋白后，对重组蛋白进行定量测 定。Westernblot、ELISA方法初步鉴定其抗原特异性及反应 性。 3．真核表达质粒的大量提取：碱裂解法分别大量提取 量备用。 4．动物免疫：取40只4周龄BALB／c小鼠随机分成4 sap2联合质粒组及PBS对照组，股四头肌接种真核表达质 粒，每只100lag／次，每次间隔2周，加强免疫3次，每次免 中文摘要 疫前内眦取血收集血清。 5．免疫效果检测：间接ELISA法检测各免疫组血清特 异性抗．MP65、抗．Sap2．IgG；流式细胞术检测小鼠脾脏内 CD4+、CD8+淋巴细胞变化情况。 6．攻毒实验：末次免疫后20天尾静脉注射给予小鼠致 死量白色念珠菌l×106个／只，15天内观察存活率。 结果：1．经RT-PCR方法克隆出全长为1 140bp的rap65 序列基本同源。 转化BL．21，经SDS．PAGE和Westernblot证实，分别诱导 的蛋白主要以包涵体形式存在。 疫动物后，各免疫组小鼠血清IgG水平随免疫时间延长，抗 体滴度逐渐升高。末次免疫后，抗．MP65 IgG最高效价可达 到1：1600，抗．Sap2IgG最高效价可达到l：3200。流式细胞 术检测结果经方差分析显示，两组质粒免疫后均能诱导小鼠 脾脏内CD4+T细胞百分含量增加，与PBS对照组比较有显 著性差异(Po．05)。而CD8+T细胞百分含量无明显差异。 两种质粒单独免疫组与联合免疫组比较也无显著性差异。 4．白色念珠菌攻毒1