中国HIV%2fAIDS患者外周血单个核细胞APOBEC3G表达水平及病毒Vif变异和疾病进展的相关性的研究.pdf

方法 1、研究对象 由河南省疾病预防与控制中心以及中国医科大学艾滋病研究所艾滋病确认实 验室经Westernblot试验确认为阳性，未经抗病毒治疗的HIV／AIDS患者。调查与 采血前征得患者同意，并签订知情同意协议。患者血浆标本病毒核酸经套式聚合 染时间和CD4+T细胞数量分为缓慢进展组(SlowProgressor，SP)：感染时间 合并艾滋病指征性疾病。HIV抗体阴性健康对照来自河南省。 2、CD4+T淋巴细胞计数 应用美国BECTON CD4+、CD8+、CD3+T淋巴细胞绝对值。将20山CD4／CD8／CD3TRITEST试剂加 室温避光15min，FACSMULTISET软件检测并进行自动分析。 3、病毒载量测定 Monitor1．5commercial kit在COBAS 定病毒载量。HIV病毒载量经lOglo对数转化后用于统计分析。 4、标准品质粒的构建 RNeasy Reverse Transcription 到DH5a感受态菌中，蓝白筛选后获得阳性克隆，测序验证，纯化重组质粒，紫 外分光光度计定量后根据分子量换算为分子拷贝数，10倍系列稀释质粒制备质粒 2 标准品。 5、实时定量PCR检测APOBEC3GmRNA水平 取健康对照和HIV感染者EDTA抗凝全血10“，常规提取外周血PBMC。 mini 采用Qiagen公司的RNeasy ImProm．iiTMReverse TranscriptionSysterm和随机引物逆转录合成eDNA。 APOBEC3G(NM021822)和内参GAPDH(NM002046．3)特异性探针序列为 X PCRMasterMix1 X 25p．1实时PCR反应体系：2 2．5m，20 TaqMan@Universal Gene TaqManExpressionAssay 2 10 15S、 用ABI mill，950C 7500实时PCR仪进行检测，反应条件500C m吐950C 600C1 rain 40循环。APOBEC3G和GAPDHmRNA绝对拷贝数由系列稀释的质 粒构建的标准曲线获得，每份标本设2个复孔结果取均值。 6、Western blot方法检测PBMC中APOBEC3G蛋白量 X上样 于式转印到硝酸纤维素膜上，脱脂奶粉封闭，按预染标记的分子量剪裁转印膜， 40C过夜，洗膜，加入HRP标记的羊抗兔二抗，370C30min，ECL发光显色，图 像采集及分析处理。 列分析 (1)套氏聚合酶链反应(Nest．PCR)扩增HIV．1前病毒Vif基因 Blood kit(Qiagen)提取前病毒基因 取每例感染者全血lml，应用Qtaamp 3 GelExtraction QIAquik Kit试剂盒纯化基因片段。将纯化后的PCR产物，以Vif3、 Terminator Vif4为测序引物，使用美国AppliedBiosystem公司的BigDye 377型DNA测序仪进行测序。 Sequencing试剂盒和ABI (2)Vif核苷酸和氨基