β-半乳糖苷酶EA、ED融合蛋白的表达及其初步功能的分析.pdfVIP

!二兰塾塑蔓酶．曼A、ED塾兰三璧皇的表达及初步功能研究 研究生：张钧 导师：沈建根 摘要 酶免疫分析技术自1971年创立以来，己广泛用于生物标记物 的检测。酶免疫分析技术的质量依赖于抗原的纯度、抗体的特异 性、合适标记酶的选用，其灵敏度取决于标记酶的高度纯化和高 转化率。利用基因工程生产诊断用酶，使酶的纯度大大提高，产 量及质量均较自然来源酶好，简化了制备程序，大大促进了酶免 疫分析技术的发展。 大肠杆菌的B一半乳糖苷酶，因人血浆中缺乏此酶，并具有大 量易得的底物，被用于均相及非均相免疫分析，是目前最常用的 标记酶之一。Henderson等人在1986年利用基因工程技术生产大 肠杆菌B一半乳糖苷酶酶受体(EA)和酶供体(ED)，并利用其a一 互补功能创立了克隆酶供体免疫分析(CEDIA)技术。B一半乳糖 苷酶的EA、ED这种a一互补性还被用于分子生物学、蛋白质相互 作用的监控、表达免疫分析等方面的研究。 厂、犊验目的 利用pGEX一4T一2融合蛋白表达系统制备重组B一半乳糖苷 酶EA／ED蛋白，并对其活性进行研究，为进一步研究CEDIA开发 新的试剂盒和利用B一半乳糖苷酶的a一互补特性进行表达免疫分 1 、 析等打下基础。 实验方法 通过人工合成编码B一半乳糖苷酶印蛋白的DNA并插入原核 controlvector 表达载体pGEX一4T一2；从PSV—B—galactosidase 质粒中用SalI及EarI进行双酶切得到编码B一半乳糖苷酶a一 受体(EA)的大部分DNA，N端再加上约60bp人工合成DNA，连接 d， 后转入pGEX一4T一2载体中。把重组质粒分别转化大肠杆菌DH5 并经IPTG诱导表达，经Glutathione4B亲和层析 sepharose GST-EA、GST—ED蛋白，再以凝血酶酶切得到纯的EA、ED蛋白，并 以ONPG为底物，检测EA、即蛋白的d一互补活性。以兔抗B一半 乳糖苷酶抗体做western—blot以证实与GST融合表达的EA、ED蛋 白是13一半乳糖苷酶的成分。 实验结果 1．限制性内切酶和DNA测序结果表明，编码EA及ED蛋白的 的表达质粒； 2．经诱导表达超声破碎后，GsT_ED融合蛋白约占表达菌可溶 性蛋白的25％，GST—EA融合蛋白约占表达菌可溶性蛋白的18％； GST—EA蛋白、GST-ED蛋白均主要存在于上清液中，经亲和层析回 收融合蛋白， 每升诱导菌分别可得GST—EA蛋白1．6mg，GST—ED 蛋白2．9mg。 3．Western—blot证实EA、ED蛋白均为B一半乳糖苷酶的片段。 4．EA、ED蛋白的d一互补功能试验证实制备的EA、ED蛋白能 2 成功互补，形成具有高活性的B一半乳糖苷酶。 实验结论 1．构建的质粒能高效表达具有较高a一互补活性的GST-趣A 蛋白、GST_ED蛋白。 2．我们制备的EA蛋白、ED蛋白能用于研究B一半乳糖苷酶的 。一互补，为制备克隆酶供体免疫分析试剂打下了基础jy／ EA EDof and fusion Preparing 8一galactosidase(E．coil)by anditsfunction protein