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斑马鱼缺氧诱导因子．3仅核定位信号的研究 斑马鱼缺氧诱导因子-3a核定位信号的研究 摘要 缺氧诱导因子(Hypoxia．inducible 氧气浓度的降低而对多种基因进行调控的转录因子家族，与生物体的生长、发育 及一些疾病的发病机理都有着密切的联系。由于生物体内缺氧现象较为普遍，所 以有关HIF的结构、功能以及与多种疾病之间的关系等一直是热门的研究领域。 HIF是一种异源二聚体蛋白，由仅亚基和p亚基组成，其中a亚基受细胞内氧气 浓度精密调控，对HIF功能的发挥是十分关键的。哺乳动物中HIF．a一共有三个 复合体调控相关基因的表达。 根据对HIF．1 基因的转录激活功能方面都受到细胞内多条途径的调节。作为转录因子，HIF．a 蛋白是否能从细胞质成功被转运进入细胞核是其发挥功能的前提，所以针对 HIF—Q在细胞中亚定位的研究十分必要。己知分子量大于50kDa的蛋白质不同于 小分子，它们需要通过消耗能量的主动运输过程才能穿越核孔复合体进入到细胞 localization 核中，在这些蛋白结构上往往存在特殊的核定位信号(nuclear signal， NLS)使得能够蛋白质被成功转运入核内。文献报道，在细胞中检测外源性或内 导两种蛋白的表达全部集中于核内。在HIF．1O【和HIF．2a的蛋白结构中，研究者 已经发现并证明了核定位信号存在的具体位点。在它们的C．端区域都包含有一 段富含碱性氨基酸(Lys和Arg)的片段，当这些氨基酸被删除或被替换成其它 氨基酸时蛋白便完全失去进入细胞核的能力。然而，由于HIF．3a较前两者较晚 被克隆得到，所以目前对该蛋白是否也为核内蛋白，其进核能力是否会受到氧气 浓度的影响以及该蛋白结构上是否也存在核定位信号等等一系列的问题尚未得 到解答。本研究的目的就是要对上述疑问一一进行探讨。我们以斑马鱼Hif-3a 作为对象观察该蛋白在细胞中的核质分布以及确定其核定位信号存在的位点。我 基酸。通过氨基酸序列比对发现该蛋白和人类的HIF．3a相似性在40％左右，说 4 斑马鱼缺氧诱导因子．3旺核定位信号的研究 明两者的保守性比较高。利用Hif-3a进行核定位信号的研究能够帮助我们完善 对三种HIF—a亚基在结构上相同点和不同点的认识。 建成融合蛋白后用相应的质粒瞬时转染Hela细胞后我们发现，在常氧时 Hif-3a—EGFP蛋白便已能够集中于细胞核分布，缺氧并不能对它的细胞亚定位产 生影响。而N．端或C．端区域缺失突变体转染结果提示Hif-3a的C．端区域具有进 个片段中都存在碱性氨基酸对其功能的发挥有不可或缺的作用，它们分别为 后也使得蛋白的进核能力明显减弱。在这两个碱性氨基酸簇之间有一段长为52 个氨基酸的连接区域，这些氨基酸共同组成一段有核定位功能的结构域，我们将 其命名为Hif-3a的核定位信号。值得注意的是，我们发现Hif-3aN．端的第1．69 位氨基酸片段也能够介导13-Gal．EGFP进入细胞核中，其中发挥作用的氨基酸为 R14，K15，R25和R26。但是在全长蛋白中该片段却并没有真正的核定位功能， 这与之前在HIF．1a和HIF．2a中的研究结果相一致。最后将不同物种一共9种 酸在HIF．a是保守存在的。 综上所述，斑马鱼Hif-3a是一种不受氧气浓度影响集中于细胞核分布的蛋 白质，在其C．端存在一段有功能的核定位信号，其中几个碱性氨基酸发挥主要 的核定位功能。 关键词：缺氧诱导因子-3a；核定位信号；细胞质；细胞核。 斑马鱼缺氧诱导因子．3a核定位信号的研究 Identificationofnuclearlocalizationof signal zebrafish factor-3 hypoxia-induciblealpha Abstract HIFsarecrucial