光动力学疗诱导细胞凋亡机制的初步研究.pdfVIP

!苎塑茎 一———— 摘要 细胞凋亡是机体生命活动中重要的细胞学事件，在许多疾病的治疗中也起着 关键性作用。光动力学疗法(PDD是一种治疗癌症的新的技术，由它所引起细胞 的死亡多以凋亡的形式发生，但由PDT引起的细胞的凋亡机制及其内部的调节 过程都很复杂。本论文在充分调研国际、国内有关PDT凋亡研究的历史和进展 的前提下，将FRET技术和化学发光探针运用到PDT凋亡机理的研究，得到了 初步但非常有意义的结果，证明这两种方法在凋亡机理研究中的可行性。 本文首先概述了有关光动力疗法的基本知识以及治疗肿瘤的机制，总结了细 胞凋亡相关蛋白的基本信息以及与细胞凋亡通路的调节，并对FRET技术的基本 原理以及在蛋白相互作用的应用情况做了简要的描述。 本论文分三个部分详细介绍了实验工作： 在第一部分的实验工作中，运用荧光共振能量转移(FRET)成像技术监测在 肿瘤坏死因子(TNF，cc)和光动力作用诱导凋亡过程中细胞内caspase一3的活性， 并对在凋亡前后细胞内稳定表达的荧光蛋白发射光谱的改变及FRET探针稳定 表达后在细胞内的分布情况进行了研究。实验结果显示：FRET探针稳定表达后 在细胞中细胞核和细胞质中均有分布；且细胞在凋亡前后的荧光发射光谱有明显 的变化，而PDT作用时的照射激光对探针的FRET效率并无影响。对细胞进行 FRET成像分析发现：未经任何处理的荧光细胞中CFP和Y即的荧光强度无明 显的改变；经TNF一0【或PDT处理的细胞，荧光蛋白CFP／YFP的比率有明显的增 3活性的增强，说明不论 加。荧光探针的CFP／YFP的上升反应了细胞内caspase 3 探针成像的检测技术，可以在活细胞水平实时监测PDT过程中细胞内caspase 活性改变以及凋亡的启动。 在第二部分的实验工作中，为研究Photofrin-PDT所引起的细胞凋亡的凋亡通 测。结果发现Photofrin结合到线粒体膜上，由于光敏作用导致的损伤主要发生 在光敏剂结合位点附近几个纳米的范围内，因此线粒体为Photo施n．PDT诱导的 中文摘要 凋亡仅有线粒体通路参与，没有死亡受体通路的介入。通过FRET对由死亡受体 凋亡中，caspase一3的启动需要3小时以上。而在PDT诱导的凋亡中，无论是 了Photofrin．PDT诱导的凋亡由线粒体中介的；而在死亡受体和线粒体所介导的 凋亡中，caspase一3的活化的启动以及活化速度不同，由死亡受体所介导的 caspase一3的活化要慢于线粒体路径所介导的：线粒体是引起细胞凋亡最有效的 作用靶点。FRET技术还可运用于不同凋亡刺激下的不同凋亡通路所介导的凋亡 信号的传递的差异的研究。 在第三部分的实验工作中，主要介绍了FCLA和HpD的跨膜效率以及细胞内 定位的形态学研究初步结果，发现HpD和FCLA都可以有效地跨膜，并分布在 细胞质中。虽然FCLA与HpD的分子量大小相似，但是其进入肿瘤细胞的效率 却并不相同。与HpD相比，FCLA更易通过细胞膜，其在细胞质内的潴留量只 需要共培养30--45分钟就可达到最大。而npD则需要共培养20小时左右才达 到接近饱和。随着培养时间的继续延长直至48小时，细胞内光敏剂的潴留量没 有明显变化。实验中并未观测到FCLA和}如D进入细胞核的证据。该研究为利 础，并将推动在细胞或亚细胞水平上进行光动力学机制以及光敏过程引起细胞凋 亡机制的研究。 关键词： 光动力学疗法(PDT)；细胞凋亡；荧光共振能量转移(FRET)： Caspase-3；肿瘤坏死因子(TNF．ct)：FCLA II ABSTRACT that a rolein and event isa cellul