RNA干扰细胞周期检测点激酶CHK1与CHK2表达对食管癌细胞照射后细胞周期阻滞的消除作用.pdf

中文 摘 要 RNA干扰细胞周期检测点激酶CHKI和CHK2表达对 食管癌细胞照射后细胞周期阻滞的消除作用 摘 要 我国是食管癌高发国家，发病人数约占全世界50%以上。临床就诊的 食管癌病人多数为中晚期，需要接受放射治疗 (放疗)，放疗成为中晚期 食管癌主要治疗方法之一。但食管鳞癌属于中度放射敏感肿瘤，单纯放疗 后5年生存率较低，但肿瘤局部未控和复发率很高;如何提高食管癌细胞 的放射敏感性，提高肿瘤局部控制率、减少复发而提高疗效，始终是研究 的热点和难题。 DNA是放射线作用的主要靶分子，当放射线照射引起DNA损伤发生 后，DNA损伤修复系统立即启动，并激活细胞周期检测点出现细胞周期 阻滞，促进损伤DNA的修复。细胞周期检测点激酶1和2(CHKI和CHK2) 是细胞周期检测点中非常重要的蛋白激酶，它们通过信号传导和放大，调 节下游靶蛋白表达，使细胞周期出现阻滞。抑制CHKI和CHK2蛋白表达， 可有效地消除肿瘤细胞在放射线或化疗药物作用后的细胞周期阻滞，增加 放化疗的敏感性。但在食管癌细胞和食管癌组织中，CHKI和CHK2蛋白 表达情况如何、照射后对细胞周期检测点如何调节，尚未见报道。 本研究首先观察食管癌细胞、食管癌组织以及癌旁不典型增生组织中 CHKI和CHK2表达情况，并了解CHKI和CHK2表达与食管癌发生、发展 以及单纯放疗疗效的关系;其次，观察体外培养的食管癌细胞在单纯照射 或照射加药物wortmannin(以下简称WT)共同作用后，对食管癌细胞中 CHKI和CHK2表达、细胞周期变化以及放射敏感性的影响;最后，通过 脂质体介导的CHKI和CHK2反义寡核昔酸转染技术以及脂质体介导、质 粒连接CHK1和CHK2短发卡状RNA(shRNA)的RNA干扰 (RNAi)技术， 探讨食管癌细胞转染前后，对CHKI和CHK2表达的变化以及照射后细胞 周期的影响，为进一步进行体内和临床前期研究创造条件。 第一部分 CHKI和CHK2在食管癌细胞和组织中的表达及其临床意义 目的:观察食管癌细胞、食管癌组织以及癌旁不典型增生组织中 CHK1和CHK2的表达情况，了解食管癌组织中CHKI和CHK2表达与其发 1 中文 摘 要 展及单纯放疗疗效的关系。 方法:在人食管癌细胞株TE-1,TE-13和Eca109细胞中，采用逆转录 一聚合酶链反应(RTPCR)检测CHK1和CHK2mRNA表达，免疫组织化学 法、westernblotting和流式细胞技术 (FCM)间接免疫荧光法检测CHK1 和CHK2蛋白表达。收集33例放疗前胃镜活检诊断为食管鳞状细胞癌的肿 瘤组织标木，其中12例同时收集癌旁不典型增生组织标本，应用western blotting检测组织标本中CHK1和CHK2表达，并分析单纯放疗疗效及预后 相关因素。 结果:(DTE-1,TE-13和Eca109食管癌细胞中CHKI和CHK2在mRNA 和蛋白上均有表达，33例食管癌组织和12例癌旁不典型增生组织中也均有 CHK1和CHK2表达蛋白:利用半定量法发现，食管癌组织和癌旁不典型 增生组织中CHKI和CHK2表达量无明显差别，P值0.05.②33例食管癌 病人单纯放疗后1年生存率为61.44%，中位生存期11.5个月，放疗后CR21 例、PR12例，总有效率 (CR+RP)为100%。单因素分析显示年龄、X线 食管造影病变长度、CT检查病变长度、临床T分期、N分期、近期疗效以 及临床分期均与食管癌单纯放疗预后有关，P值0.05;COX多因素分析 仅临床分期为独立预后因素，而食管癌组织中CHK1和CHK2表达与预后 未见明显关系，P值0.05. 结论:食管癌细胞、食管癌组织和癌旁不典型增生组织中均有CHK1 和CHK2蛋白表达，CHK1和CHK2可能与食管癌发生、发展以及单纯放射 治疗疗效无明显关系;临床分期是影响食管癌单纯放疗疗效的主要因素。 第二部分单纯照射或合并，ortmannin对食管癌细胞周期及细胞周期检 测点激酶CHKI和CHK2表达的影响 目的:观察食管癌细胞的放射敏感性以及单纯照射后细胞周期和细胞 周期检测点激酶CHK1和CHK2表达的改变，同时