海水浮游病毒提取技术及荧光显微计数方法.pdfVIP

海水中浮游病毒的提取纯化及其荧光显微计数定量研究 海水浮游病毒提取技术及其荧光显微计数方法 摘要 海洋中病毒含量极其丰富，多种多样，是海洋中最普通的生物群体，是海洋生 物化学循环中最大的一环，在微生物食物环中有着重要的生态学意义，可以影响 许多生物地球化学过程和生态学过程，海洋病毒能够侵染多种海洋生物，是海洋 中最主要的致命体，几乎对所有的海洋生物都有所影响，众所周知，由病毒引起 的病毒性传染疾病，给世界水产养殖业带来巨大危害和损失，是水产养殖业发展 中急待解决的一大难题。 尽管如此，直到近几年，人们对海洋病毒的认识仍然大大落后于其实际存在。 et et 近十年来，随着技术的不断进步，Bergha1．(1989)、Suttle ct (1999)、Kirchman(1999)和Mann 洋病毒生态作用的报告，人们才逐渐意识到海洋病毒的生态意义。 因此，开展对海洋游离病毒的基础性研究，对不同海域的病毒进行分离，建 立我国不同海域的病毒分离物资源保存库和病毒基因库，将对海洋病毒生态学及 流行病学研究提供前提，对海洋生态动力学的学科创新、海水养殖业病毒害防治 和海水病毒的快速检测鉴定具有重要意义。 本论文在农业部海水养殖生物疾病控制与分子病理学实验室开放课题资助 下，对海水中浮游病毒的存在及分布进行了研究，初步建立了高效、快速、高通 量提取纯化海洋病毒的方法，对青岛及附近海区的海水中浮游病毒做了荧光显微 计数定量，对浓缩分离后的病毒做了基因文库构建的初步研究。 为了从海水中提取纯化病毒，本文对吸附洗脱法、化学絮凝法等浓缩方法进 行了探索和尝试，最后利用三氯化铝沉淀病毒，同时加入滑石粉一硅藻土作为病毒 吸附剂促进病毒吸附沉淀的方法，初步建立起了一种可以通过处理大体积海水浓 2 海水中浮游病毒的提取纯化及其荧光显微计数定量研究 缩病毒的海水病毒提取方法，在青岛近海海域的海水中成功提取N-；游离的病毒。 电镜观察的结果表明，海水中不仅存在着一定丰度的游离病毒，而且病毒的种类 多种多样。病毒形态有具纤突的球状病毒、不具纤突的球状病毒和杆状病毒、噬 菌体等，病毒粒子大小在40nm一400nnl之间。 酚抽提法提取浓缩纯化后的病毒的核酸，分别机械剪切和酶切，利用大肠杆 菌DH一5ct菌株尝试构建病毒的基因组文库，经Ⅱ互补筛选获得了呈现阳性的菌株， 但PCR和酶切初步分析鉴定的结果中未有外源基因片段插入。对提取纯化的病毒 做红外吸收定量分析表明，病毒的浓度太低，对病毒核酸的酶切电泳分析表明，所 获得的混合病毒核酸型无法确定，需要建立病毒的有效筛选途径，来实现对不同病 毒的检测和进一步分离。 为了对海水中病毒的数量和分布有所了解，我们采用新型荧光核酸染料SYBR Green I对青岛海区海水中的浮游病毒作了显微计数研究。通过图像分析软件对显 微观察结果所作的定量分析，发现病毒在海水中的浓度随水样采集地点和时间的 Green 不同而存在着显著的差异。同时也表明，SYBR I染色显微计数的方法，简 便、准确、灵敏度高，可以做为水中病毒的数量动态研究的方法和手段。 关键词：海洋病毒；提取纯化；荧光显微计数；基因文库 海水中浮游病毒的提取纯化及其荧光显微计数定量研究 andFI uorescentMi Counti Extractingtechniques crOscopeng MethodofMariReViruses Abstract Oceanisthecradleoflife．Withthe of andthemore developingte