连接酶链式应均相检测单核苷酸多态性.pdfVIP

Classified IndeX： CODE：1OO75 U.D.C.： NO：2OO9O947 A Dissertation for the Degree of M.S SensitiVe and Homogeneous Detection of Single Nucleotide Polymorphism With Ligase Chain Reaction Candidate： Du Qin SuperVisor： Li Zhengpin ;;ChengYongqian ;; Academic Degree Applied for： Masters Degree Specialty： Analytical Chemistry UniVersity： Hebei UniVersity Date of Oral EXamination： June， 2O12 摘 要 摘 要 连接酶链式反应 （LCR ）为核酸扩增提供了一个简单 灵敏和高选择性的检测平台 。 但是由于 LCR 反应产物通常需要凝胶电泳分离或者异相分析方怯检测，大大限制了其 被广泛应用 。本论文研究了一种新型的均相 LCR 检测的新方怯 。该方怯利用 LCR 扩增 和阳离子共轭聚合物 （CCPS ）作为指示剂均相检测单核苷酸多态性 （SNP ）。方怯中 ， 我们设计了两对与靶序列互补的探针，每一对探针中包含有两条毗邻的探针，其中一个 探针的 3 末端硫代修饰，另一个探针的 5 末端标记荧光素 。当 LCR 反应完成后，两条 相邻的探针连接成一条 DNA 链。这条 DNA 链的 5 末端标记荧光，3 末端为硫代修饰 。 由于核酸外切酶对硫代修饰碱基无作用，因此，在 LCR 产物中加入外切酶 Ⅰ和外切酶 Ⅲ后，LCR 产物不会被降解 。当加入阳离子共轭聚合物后，CCP 和 DNA 通过强的静电 引力结合，可发生高效的荧光共振能量转移 。相对照，如靶序列与设计探针有一个碱基 错配，在高特异性 DNA 连接酶作用下，不会发生 LCR 反应。溶液中没有被连接的荧光 标记的 DNA 链会被外切酶 I 和外切酶 III 降解成单核苷酸，由于荧光标记的单核苷酸和 CCP 之间的静电引力很弱，不能发生有效的荧光共振能量转移。因此，应用 LCR 扩增 和 CCP 做指示剂可实现 SNP 的均相检测。方怯可以灵敏检测 1 fM 的 DNA 分子，可以 实现 1％等位基因突变频率的检测 。这种方怯扩展了 LCR 反应的应用，提供了一种新的 均相检测 SNP 的方怯。 关键词 单核苷酸多态性 （SNP ） 连接酶链式反应 （LCR ） 阳离子共轭聚合物 （CCPS ） 荧光共振能量转移 （FRET ） I AbStract Abstract LigaSe chain reaction （LCR） offerS a Simpl