蛋白质的磁微球快速酶解与高效富集新方法研究.pdf

摘 要 本论文针对蛋白质组学研究中面临的快速酶解以及磷酸化蛋白高效选择性 富集方面的热点难点问题，将功能化磁性微球与蛋白质分析结合起来，开展了一 系列研究工作，发展了相关的新技术新方法并进行了实际的应用研究，取得了一 些创新性研究结果。主要研究内容和取得的主要研究成果摘要如下： 第一章概述了蛋白质组学研究的现状，基于生物质谱的蛋白质组学研究技术 以及新兴的翻译后修饰蛋白组学的重要意义；就目前固定化酶反应器及其在蛋白 质组学研究中的应用，以及磷酸化蛋白质组学研究中的富集技术研究进展进行了 综述；概述了功能化磁性微球及其在生物分析中的应用；最后提出了本论文选题 的目的和意义。 第二章分别运用金属离子螯合和共价键合两条技术路线，合成了表面固定酶 的磁性硅球材料并将其应用于毛细管／微流控芯片酶解反应器。首先，采用水热 法制备了具有超顺磁性的四氧化三铁磁性微球；然后采用溶胶．凝胶法在其表面 包覆二氧化硅层，合成了具有核壳结构的Fe304@S102磁性硅球。在此基础上， 发展了两条不同的固定酶的方法，即金属离子螯合法和共价键合法，将胰蛋白酶 固定在磁性硅球表面。 利用外加磁场的作用，在不需要制作塞子的情况下，将用两种不同方法合成 的固定酶的磁性硅球分别填充到毛细管或者微流控芯片通道内部。蛋白质溶液在 泵的推动下，流过毛细管或者微流控芯片通道，从而得到快速的酶解。使用 MALDI质谱对收集到的酶解产物进行分析鉴定。结果表明，用两种不同的固定 酶方法制得的毛细管／微流控芯片酶反应器均能在5分钟的酶解时间内达到与12 小时传统溶液酶解相同或更好的酶解效果。该方法易于操作、成本低；由于材料 的磁性，毛细管／芯片通道内的磁性微球还可以进行方便快速地替换，很好地解 决了以前文献报道中毛细管／芯片酶反应器只能一次性使用的缺点。对用金属离 子螯合方法固定酶的磁性微球而言，还可以用EDTA将磁性微球表面的铜离子除 去，再重新引入新韵铜离子和蛋白酶，从而实现毛细管／微流控芯片酶反应器的 再生。 第三章发展了更为简便的方法，运用一步水热法合成了氨基四氧化三铁磁性 微球，从而将固定酶的磁性微球的合成步骤由第二章中的6步简化到3步，大大 缩短了合成的时间。 在上述工作的基础上，将固定酶的磁件微球进一步应用于蛋白质的靶上酶 解。将磁性微球分散液滴加到已经预先滴加好蛋白溶液的靶板上，酶解一段时间 后，用磁化的钢针把固定酶的磁性微球从靶板上分离出来，从而终止酶解过程。 第1页 这样，我们既利用了固定化酶技术提高了酶解效率，又避免了对质谱离子源光栅 的污染。最后，为了证实本方法在复杂生物样品检测中的实际应用性，我们对大 鼠肝脏提取蛋白的液相色谱流分就行了酶解鉴定。 第四章针对翻译后修饰蛋白质组研究中亟待解决的磷酸化蛋白及肽段的分 面键合上可以螯合金属离子的官能基团，再将对磷酸化蛋白／肽段有特异性吸附 作用的铈离子固定在磁球表面。由于材料的磁性，当磷酸化肽段富集到磁性微球 上以后，只需将磁铁放置在盛放溶液的离心管外壁，就可以轻松实现富集了磷酸 化肽段的磁性微球与非磷酸化肽段溶液的分离。文献调研显示，Fe3+和Ga3+是 IMAC富集中最常使用的金属离子，而目前尚未有将Ce4十成功地应用于磷酸化肽 富集的文献见诸报道。因此，在本论文中，我们还进一步比较了整合Ce4+的磁性 微球与螫合Fe”的磁性微球对磷酸化肽段的富集效率。结果表明，螯合Ce4+的磁 性微球对复杂混合物中磷酸化肽段的选择性富集效果优于螯合Fe3+的磁性微球。 的磁性微球仍可在30 S内将13-casein中的痕量磷酸化肽段有效地富集出来。在此 基础上，我们还首次成功地将螯合Ce4+的磁性微球用于选择性富集人血清中(不 需要其它的预处理步骤)的磷酸化肽段，为磷酸化蛋白质组学的研究开辟了新的 道路。 第五章创新性地探索了在四氧化三铁磁性微球表面均匀包覆过渡金属氧化 物的新方法。采用磁球外部包覆碳层为模板包覆过渡金属氧化物、随后灼烧去除 碳层的方法，制备了结构紧密的具有核壳结构的Fe304@MxOy超顺磁性微球。 该磁性微球具有与IMAC材料不同的富集机理，具有更高的化学惰性和稳定性。 利用该方法将不同的过渡金属氧化物，如A1203，Zr02，Ga203等分别包覆到四 氧化三铁磁性微球表面。采用振动样品磁场计、傅立叶变换红外光谱仪、透射及 扫描电子显微镜等对产物进