Taq DNA合酶耐热域的克隆及分析.pdf

II IIIII {IIllllll lllIlllll Y1 DNA聚合酶耐热域的克隆及分析 勋12r 摘 要 1988年，Randall K．SaiE等呻1从水生栖热菌(Thermusaquatics) 中分离纯化到7raqDNA聚合酶，之后它广泛应用-TPCR技术。Taq DNA聚合酶在95℃的条件下仍然有较高的活性，与其高同源性的大 DNA聚合酶具 肠杆菌的DNA聚合酶则不具备高耐热特性。这提示Taq DNA聚合 有耐热标记。本实验，用质粒pET-32a亚克隆并表达TTaq 酶的多个区域，测定并分析了其耐热性，获得了耐热区段H(399 bp)。 factor DNA聚合酶的H区段，是一个高效 growthII)。结果表明，Taq 的耐热标签，能够荷载1：l大小的非耐热蛋白。利用该耐热标签，85℃ 热处理一小时得到高纯度(90％)的嵌合蛋白。 本实验，用热纯化方法、亲和层析法所得嵌合蛋白、及非H区段 免疫小鼠，发现，热纯化和亲和层析法所获得的嵌合蛋白抗体效价相 近(pO．05)，H区段标记的嵌合蛋白效价在极显著水平上高于无H区 段标记的蛋白(pO．01)。实验结果表明，H是一个高效的耐热蛋白标 记。在以制备不依赖于蛋白构象的蛋白、并以之为免疫原获得抗体时， 以H为标签的热纯化方法，简单经济，可以替代6xHis标签的亲和层析 纯化方法。 综上，本实验为获得单克隆抗体为目的的线性表位抗原制备，提 供了高效的耐热标签及简单经济的热纯化方法。 DNA粼} 关键词：耐热标签；热纯化；Taq II CLONINGAND ANALYSISOFTHE INTA DOMAINSDNAPOLYMERASE Q AB STRACT DNA hadbeen After死g isolatedand fromthe polymerase purified us habitat thermophilicbacteria(Therm RandallK． aquatics)inaquatic by Saiki andhis in1 was usedinPCR colleagues988，itwidely techniques． wasstillretained Highactivity withinDNA