产β-甘露聚糖内生菌的筛选及酶学特性研究.pdf

摘要 邰．1，4．D．甘露糖糖昔键的内切水解酶，属于半纤维素酶类。目前，国内外有关于筛选 产伊甘露聚糖酶菌株的报道大多限于从土壤或水体中分离产的菌株。自1898年Vogl从黑 麦草种子内分离出第一株内生真菌以来，植物内生茵作为一种新的微生物资源受到了广 泛的关注，有关于植物内生菌的研究最初主要集中于拮抗菌的筛选，近几年更关注于产 生物活性物质菌株的分离，但在产酶菌株筛选方面国内外见相关报道很少，本研究尝试 在内生菌中筛选即．甘露聚糖酶的菌株。 本研究采用富集培养的方法从富含甘露聚糖的植物组织中分离出46株内生菌菌 株，利用刚果红染色法筛进行初筛，选出7株产．声一甘露聚糖酶的内生菌菌株。采用 摇瓶培养和测定其酶活力方法，复筛出2株产酶能力较高的菌株CH．．3和HD．1，其 U／mL和54 酶活力分别达42 U／mL，具有较高的研究价值。 克隆并测定菌株CH．3的16S rDNA序列同源性比较，发现CH．3的16S strainYRLl3 polymyxa EU373421)相似度达97％。结合它的形态观察及生理生化试验， 初步鉴定CH．3为类芽孢杆菌属细菌Paenibacillus 克隆菌株HD．1的16S subtilis rDNA序列同源性比较，发现HD．1的16SrDNA序列与芽孢杆属细菌(Bacillus 孢杆属细菌Bacillus sp．(Genbank登录号为HQ329104)。 酶学性质的分析发现，菌株CH．3产生的．声一甘露聚糖酶最适作用温度和pH分别 为40℃和5．0—8．O之间；该酶在50℃保温2 5．0一lO．0条件 h酶活仍保留63％，pH 下保温1h酶活仍保留66％以上；Fe2+、Ca2+、Co”、对该酶有激活作用，其中以 有抑制作用。菌株HD．1产生的夕一甘露聚糖酶最适作用温度和pH分别为30℃-50℃ 和7．0；该酶在50℃保温2 5．0-9．0条件下保温1h酶活仍 h酶活仍保留68％，pH 保留64％以上， 活作用最为显著，使酶活提高了31％；Mn2+和EDTA对该酶有抑制作用。 通过对发酵温度、培养基初始pH值的单因素试验和转速、发酵时间和接种量等 的正交试验对HD．1产俨甘露聚糖酶的影响的研究，得到HD．1的最佳培养条件为： r／min，发酵72h，接种量为5％。以摇瓶发酵培 培养温度35℃，初始pH值7．0，200 养基为基础，对碳源的种类和浓度、氮源的种类、氮源与碳源的比例进行的单因素优化， 对发酵培养基中的离子浓度进行正交试验优化，得到最优的离子浓度分别为FeS04 0．001％，NaCl O．01％。经过培养条件和培养基的优化，HD．1的产酶水 0．5％，MgS04 平达到98．3U／mL，约是复筛酶活力的1．8倍。 采用优化后的发酵培养基配方和培养条件在50L发酵罐中进行菌株HD．1产酶的放 h 大试验，从发酵的8h开始，每隔4h取样测其酶活力。结果表明，从发酵培养的56 开始酶活力迅速增加，在64h达到高峰期，发酵液的最高酶活力达193．12U／mL，约是 菌株复筛酶活力的3．6倍，摇瓶发酵酶活力的2倍。表明采用发酵罐生产更有利于菌株 HD．1产酶，这也为以后该菌株的工业化生产打下了基础。 关键词：内生菌，声一甘露聚糖酶，酶学特性，发酵优化 n AB STRACT kindof tothe