多不饱和脂肪酸RA和EPA合成途径在酿酒酵母中的重构.pdf

摘要 摘要 acids，PUFAs)对所有生物正常发育和 多不饱脂肪酸(Polyunsaturatedfatty 代谢是非常重要的，是维持人体健康所必需的。虽然人体能够通过前体分子(亚 油酸和a．亚麻酸)进行多不饱和脂肪酸的生物合成，但是在某些情况下体内 PUFAs的生物合成量不足以满足机体的需要，因此必须通过饮食摄入PUFAs 才能维持自身机体稳定。通常情况下PUFAs主要来源于海洋鱼类和藻类，但是 由于过度捕捞，海洋污染以及藻类生产PUFAs价格的昂贵，因此寻找一种可替 代的多不饱和脂肪酸来源成了当务之急。 近年来，随着转基因技术的开展，利用转基因作物生产多不饱和脂肪酸成 为研究热点。在生物体中，多不饱和脂肪酸花生四烯酸(ARA)和二十碳五烯 酸(EPA)的合成主要是通过两种途径进行的：A6脱氢途径和△8脱氢途径。 本实验通过对ARA和EPA在酿酒酵母中的两条合成途径进行研究，以期望获 得一条更利于多不饱和脂肪酸ARA和EPA的合成途径，为转基因作物生产 ARA和EPA提供实验依据。 本研究首先根据已经报道的△5脂肪酸脱氢酶基因序列设计引物，从三角 褐指藻的eDNA上克隆获得△5脂肪酸脱氢酶基因，命名为ptd5。将重组质粒 乳糖和外源底物DGLA和∞3．ARA的情况下，进行诱导表达。转基因工程菌株 YPTD5总脂肪酸甲酯GC分析表明，该基因编码的A5脂肪酸脱氢酶可以将 DGLA和03．ARA分别转化成ARA和EPA，转化率分别为28％和37％。 为在酿酒酵母中重构△6脱氢途径，将表达载体pYMAELO和表达载体 pYPTD5的△6延长酶转录单元和△5脱氢酶转录单元克隆到含有△6脱氢酶转 录单元的表达载体pYMl6上，构建成酿酒酵母表达载体pYMM5。将重组质粒 导剂半乳糖和外源底物LA和ALA的情况下，进行诱导表达。转基因工程菌株 YMM5总脂肪酸甲酯GC分析表明，三个基因均得到了表达，并且将底物LA 和ALA转化为终产物ARA和EPA，转化率分别为5．5％和8．3％。 摘要 为在酿酒酵母中重构△8脱氢途径，将表达载体pYEFD和表达载体pYPTD5 的△8脂肪酸脱氢酶和△5脂肪酸脱氢酶克隆到表达载体pYASE上，获得酿酒 因工程菌株YAE5。在添加诱导剂半乳糖和外源底物LA和ALA的情况下，进 行诱导表达。转基因工程菌株YAE5总脂肪酸甲酯C,-C分析表明，三个基因均 得到了表达，并且将底物LA和ALA转化为终产物ARA和EPA，且转化率分 别为9．6％和10．2％。 关键词：多不饱和脂肪酸花生四烯酸A6脱氢途径△8脱氢途径酿酒酵母 II Abstract Abstract of normal forthe Polyunsaturatedfattyacids(PUFAs)aregreatimportance andmetabolismofall are for indispensiblemaintaining development organisms，and human can from human PUFAs health．Althoughbeingssynthesize precursors acidsanda-Linolenic theamountoftheseessential (Linoleic