奶牛乳腺上皮细体外培养体系的建立及其应用.pdf

中文摘要 本研究通过比较获得有效的分离奶牛乳腺上皮细胞的方法，并证明所获细胞具正常 生理特征及功能，从而初步建立奶牛乳腺上皮细胞体外培养体系。在建立培养体系的基 础上，分别添加亚油酸、维生素A作用于细胞，初步研究其影响作用。 第一部分以泌乳奶牛乳腺组织和乳汁为材料分别用组织块接种法、机械破碎法、消 化培养法、乳汁分离法分离乳腺上皮细胞，对所获得的细胞经原代培养后进行细胞形态 ll ll g／Ⅲ1氢化可得松、lg／m1 学比较。培养体系为DMEM／F12、20％FcS、5Ⅱg／m1胰岛素、1 u 孕酮、looIu／ml青霉素、100Iu／ml链霉素、5g／ml转铁蛋白等。培养条件是置于37℃ 的5％c02培养箱中培养。结果表明，组织块接种法与乳汁分离法获得细胞，两种方法得 到的细胞的形态以鹅卵石型。和多角型为主，增殖融合有典型的乳头状结构和圆顶型结 构，并有泌乳现象。组织块接种法的乳腺上皮细胞15d开始增殖，30d可长满培养皿底 部，但纯度不高，需经常做纯化处理；乳汁中分离的细胞4—6d就开始增殖，无成纤维 细胞混杂，上皮型细胞纯度高，15d可长满培养皿，而且是获得乳腺上皮细胞的有效方 法。 第二部分对所获得的原代乳腺上皮细胞进行传代培养，并对其生物学性状及乳腺上 皮细胞特异性标志蛋白进行检测，用以证明所获得的细胞为正常生长并有一定生物学功 能的乳腺上皮细胞。通过细胞生物学性状检测，细胞接种存活率达到81％；细胞生长曲 线呈典型的“s”形，符合细胞生长的一般生物学规律；细胞群体倍增时间最短达48．7h； 所获得的细胞直径大小差异显著(组织块接种法比乳汁分离法大5岫)。经过对细胞标志 具有正常分泌乳蛋白功能，初步建立了奶牛乳腺上皮细胞的体外培养体系。 第三部分利用建立的培养体系，研究、探讨了亚油酸、维生素A对体外培养的奶牛 时，能延缓细胞增殖而亚油酸浓度增至400um01／L时，可抑制细胞正常的生长状态。维 滞阶段。 由试验可见，通过建立的培养体系而获得乳腺上皮细胞进行添加因子的处理试验， 可初步建立乳腺上皮细胞的试验模型，用于泌乳机制相关的研究工作。 关键词：奶牛乳腺上皮细胞；细胞培养体系；细胞生物学性状； 特征性蛋白；MTT 法 英文摘要(Abs”act) Culturc w鹪establishedto tlleeff~ectoflinoleicacid vitaminA system study rLA)and the anddi￡f-crentiationofBovine cells (retinoicacid，RA)onprolifemtion m枷marveDitlleliaI fBM：EC)． that 0n Thefirst examincda wasc0ⅡductedBMEC part comparativestudy of and m锄maIymandexplant，mech皿icalfra丹nentation，a蹋imilationcollagenase mill【basedonmeir BMECwereiIlcllbatedwith也e centriftl刚memod蠡rom morphology．The culturemcdia 20％fctalcalf containillgDⅧM仍12(v，y-1：1)锄d iI蛐l