枯草芽孢杆菌相性溶质结合蛋白OpuCC和肺炎链球菌粘蛋白结合蛋白Spr1345结构与功能研究.pdf

摘 要 摘 要 （I ）相容性溶质结合蛋白OpuCC 的结构生物学研究 相容性溶质（compatible solute ）的ABC （ATP-binding cassette ）转运系统对 于细胞抵御环境突然或者骤变的渗透压是非常关键的。革兰氏阳性菌枯草芽孢杆 菌（Bacillus subtilis ）进化出一套复杂的级联渗透压调节机制，其中有三个ABC 转运系统（OpuA，OpuB 和 OpuC ）在渗透压力胁迫时负责获取多种类别的相容 性溶质分子。每个 ABC 转运系统包含三种组分，以 OpuC 系统为例：底物结合 蛋白 OpuCC，负责转运底物的特异性；跨膜通道 OpuCB/OpuCD，负责转运底物 从葆外到胞内；ATPase 部分 OpuCA，负责利用水解ATP 的能量驱动底物转运。 其中，34-kDa 的脂蛋白OpuCC 是迄今发现的转运底物特异性最为广泛的底物结 合蛋白，特别是在枯草芽孢杆菌是作为肉毒碱（carnitine ）、氢嘧啶（ectoine ）和 胆碱-O-硫酸（choline-O-sulfate ）等唯一的转运系统。在本研究中，我们同时使 用荧光光谱测定法测定了 OpuCC 和 70% 同源性的OpuBC （只对胆碱有底物特异 性）的底物特异性。为了深入探讨 OpuCC 多底物结合特性的机制，我们解析了 分别结合四种底物的晶体结构，包括结合肉毒碱、甘氨酸甜菜碱、胆碱和氢嘧啶 的形式。同时，我们也解析了结合不结合任何底物的结构，这就使得我们可以了 解 OpuCC 结合底物之后的别构效应。这些结合不同底物的结构具体的底物结合 位点的作用网络是各不相同的，这就可以帮助解释为什么 OpuCC 的底物特异性 如何广泛。我们通过序列分析，发现 OpuCC 序列上的一个点突变导致其相比于 胆碱特异的同源蛋白 OpuBC 进化出这种多底物结合的特性。此外，我们还发现 了OpuCC 的一个新的功能角色，就是粘蛋白结合蛋白（mucin-binding protein ）， 很可能作为粘附分子参与枯草芽孢杆菌对于宿主消化道的组织粘附。我们的研究 将会有利于理解相容性溶质结合蛋白的底物特异性和功能发挥的结构生物学机 制。 关键词：相容性溶质 底物结合蛋白 晶体结构 枯草芽孢杆菌 荧光光谱 粘蛋白 结合蛋白 （II ）粘蛋白结合蛋白 Spr1345 的结构生物学研究 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是危害人类健康的主要致病菌之一。 它的表面蛋白(surface protein)作为毒力因子（virulence factor ）在此菌的致病机 制中发挥了关键的作用。表面蛋白主要分为三类：胆碱结合蛋白、脂蛋白和含有 V 摘 要 LPxTG 基序的蛋白。来自 R6 菌株的 22-kDa 的 Spr1345 即是 C 末端含有 LPxTG 的表面蛋白，它是肺炎链球菌中鉴定明确的很少的粘附分子之一，参与肺和呼吸 道上皮细胞表面粘蛋白的粘附和定植，并且也是迄今鉴定的最小的粘蛋白结合蛋 白。它包含一个粘蛋白结合结构域（mucin-binding domain ，MucBD ）、脯氨酸富 集的结构域（proline-rich domain ，PRD ）和含有LPxTG 基序的 C 末端区域。分 选酶 sortaseA 会在 LPxTG 的 Thr 和 Gly 之间进行切割，并把成熟的蛋白（含有 171 个残基，命名为 MF171 ）转移并共价连接到细胞壁的肽聚糖上。细胞免疫荧 光实验进一步证明粘蛋白结合结构域可以粘附在人肺细胞系 A549 的细胞膜表 面，这暗示了粘蛋白结合结构域确实是 Spr1345 参与宿主粘附的功能单位。同时， 我们利用结合实验也发现粘蛋白结合结构域与成熟蛋白相比，具有相当的粘蛋白 结合能力，由于粘蛋白结合结构域在纯化过程中比较稳定，因而我们解析了此结 构域 2.0 Å 的晶体结构，它代表了第一个结构解析的病原菌的粘蛋白结合结构域。 整体结构展现出了一个典型的免疫球蛋白样的延展型 β三明治拓扑结构，同时也 是解析的最小的具有粘蛋白结合活性