氯化锂介导Wnβ-catenin信号对经血源性间充质干细胞增殖与分化的调控.pdfVIP

摘要 氯化锂介导Wnt／p—catenin信号对经血源性问充质干细胞 增殖与分化的调控 硕士研究生： 周云帆 导 师： 关方霞教授 摘要 干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和分化潜能的细胞群体，由于其独 特的生物学特征和功能，已成为现代生物学发展迅速且广受关注的领域，干细 胞在再生医学的应用潜力也日益得到重视。然而，目前制约于细胞推广应用的 瓶颈问题是如何获得适合临床应用的干细胞来源和充足的细胞量，如何能够定 向诱导分化。 blood．derived 近年来国外学者从女性经血中分离出间充质干细胞(menstrual stem stem cells， cells，MMCs)，不仅克服了胚胎干细胞(embryonic mesenchymal marrowstem ESC)来源和伦理之争，也缓解了骨髓干细胞(bone cells，BMSCs) 经创伤途径获取和细胞数量有限的局限性。这种新型干细胞表达干细胞的基本 表面标志物，免疫源性低，具有自我更新和多向分化潜能，体外采用特定的诱导剂 处理后可以分化为神经元样细胞，为中枢神经系统疾病的治疗带来希望。然而， 国内未见相关研究报道。 干细胞发育受多条信号通路的共同参与，其中Wn邯．catenin信号通路通过 影响下游靶基因的表达变化调控干细胞的增殖与分化。有研究报道胚胎干细胞、 骨髓、脐血间充质干细胞中Wnt／lB-catenin信号的存在，可以通过添加外源性Wnt 蛋白启动或通过抑制GSK．3p、APC等信号通路成分的活性间接激活Wnt信号， 而在国内外此信号通路如何调控MMCs的生物学行为均未见相关报道。 近年来研究发现，临床常规治疗躁狂或抑郁症等精神性疾病的药物锂盐能 够刺激干细胞增殖，当干细胞培养基巾添加氯化锂时，能抑制经典Wnt信号通 摘要 制剂。 本实验在成功分离、培养MMCs的基础上，采用氯化锂作用于增殖和诱导 分化后的MMCs，RT．PCR和western 探索氯化锂是否通过介导Wnt／13．catenin信-g-通路调控MMCs的增殖和分化。 本论文共分为三部分，第一部分：MMCs的分离、培养及鉴定；第二部分： 信号通路成员13-catenin的影响。 第一部分：本课题所用经血均为健康女性志愿者提供。采用Ficoll淋巴细胞 分离液，密度梯度离心法收集经血单个核细胞贴壁培养，多次换液弃去悬浮生 长的血细胞，利用间充质干细胞较单核细胞易脱落的特点，传代纯化扩增细胞： 采用CCK-8法测定并绘制细胞增殖曲线；流式细胞术检测MMCs表面分子标记。 实验结果表明：经血中存在间充质干细胞，且能稳定传代培养；细胞增殖活力 表面标记如CD29、CD44，不表达造血干细胞标记物CD34和泛白细胞标记物 CD45，HLA—ABC低表达，几乎不表达HLA—DR，说明免疫源性较低； 第二部分：免疫细胞化学检测MMCs中是否存在神经前体细胞；采用bFGF 胞化学方法鉴定诱导后MMCs是否表达神经元特异标志基因NSE、NF。结果表 明诱导前MMCs出现Nestin阳性染色，证实MMCs中有神经前体细胞的存在。 诱导后MMCs能特异性表达NSE、NF，不表达GFAP，证明诱导后的细胞是神 经元细胞，而不是神经胶质细胞。NF、NSE mRNA表达量随诱导时间的延长逐 渐增强，可能与神经元分化的进行有关。 第三部分：在DMEM高糖培养基中分别加入不同浓度(2,4，8，10，20， 40mmol／L)的氯化锂，并持续处理MMCs 4d，进行形态学观察；C