松材线虫纤维素基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达、纯化和性质研究.pdfVIP

摘要 采用PER技术扩增了松材线虫纤维素酶的编码基因，克隆基因与已报道的纤维 2+一NTA树脂和 SDS—PAGE分析表明，IPTG诱导了纤维素酶在工程菌中表达。采用Ni 阴离子(DEAE)交换树脂对重组蛋白分离纯化，SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其纯 化程度，DNS法测定其纤维素酶的活性及其最适温度、最适pH矛rl其热稳定性、pH稳 定性。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明，亲和层析后重组蛋白质的纯度为50％左 kDa。 右，经阴离子(DEAE)交换树脂分离纯化后，只得到均一的一条带，大小为40 活性分析表明工程菌表达的重组蛋白具有纤维素酶活性，其最适温度为45C，最适pH h后，该蛋 为4．O。实验结果还证明该蛋白具有很好的热稳定性：不同温度处理1 白在45℃一65。C范围内可保持70％以上的纤维素酶酶活力，70℃以后，其纤维 素酶酶活力下降迅速，80C时其纤维素酶酶活力几乎完全丧失，45℃时剩余纤维 素酶酶活最高，可达98％；该蛋白pH稳定性也很好：其纤维素酶酶活在pH3．0—5．0 范围内其酶活稳定性逐步上升，并在pH5．0时酶活稳定性达到最高。本实验结果可 为进一步研究松材线虫纤维素酶在松萎蔫病中的作用奠定基础。 关键词： 松材线虫； 纤维素酶：基因克隆；活性 Abstract A cellulasefrom wascloned PCR，and gene Bursaphelenchusxylophilus by encoding of cloned showed tothe eellulaseBXC10．The was 99％homologyreportedgene gene into 5btoconstruct vector recombinant 5b-BXC．Then，this pET-1 expressingpET-1 WasintroducedintoE．coliBL2 construct bacterium． plasmid 1(DE3)to engineering RecombinantcellulaseWas in bacteriuminduced successfullyexpressedengineering by IPTGas SDS．Recombinantwas Ni计．N11Aresin analyzedby proteinpurifiedby and was degree SDS—PAGE， anionic(DEAE)exchangeresin，itspurification assayedby itsceUulaseWasdeterminedDNS its