斑马鱼模型用于门菌质粒毒力基因spv对感染及自噬影响的研究.pdf

致 谢 伤寒沙门菌质粒对生物膜形成的影响及分子机制 斑马鱼模型用于沙门菌质粒毒力基因spv对感染及自噬影响的研究 中文提要 I 中文提要 斑马鱼模型用于沙门菌质粒毒力基因spv对感染及自噬影响的研究 中文提要 目的： 幼年斑马鱼通体透明，用荧光菌感染后可在荧光显微镜下动态追踪细菌的分 布与播散，是研究病原菌与宿主相互作用的理想模式生物。为研究鼠伤寒沙门菌 Salmonellaentericaserovartyphimurium S.typhimurium STM （ ， ， ）感染后对斑马鱼 自噬的影响，本研究第一部分构建沙门菌-斑马鱼感染模型。为研究沙门菌质粒毒 力基因（Salmonellaplasmidvirulencegenes，spv）增强宿主菌毒力的分子机制，第 spv STM-WT spv 二部分以携带 基因的鼠伤寒沙门菌野生株 和 基因缺失突变株 STM-Δspv感染斑马鱼，探讨该基因对斑马鱼体内感染及自噬的影响，为进一步阐 明沙门菌质粒毒力基因的致病机制、防治沙门菌感染及新药靶位的发现提供理论 和实验依据。 方法： 1. 沙门菌-斑马鱼感染模型的构建及用于自噬的研究 (1) 沙门菌-斑马鱼感染模型适宜菌量的确定 UF110 72h hourspost-fertilization hpf 不同浓度鼠伤寒沙门菌 浸染受精后 （ ， ） 的幼年斑马鱼，统计斑马鱼7d 内的死亡数目并绘制存活率曲线以确定适宜的细菌 感染量。 2 () 沙门菌在斑马鱼体内的播散繁殖 greenfluorescentprotein GFP UF110 以绿色荧光蛋白（ ， ）标记的鼠伤寒沙门菌 感染72hpf幼年斑马鱼，荧光显微镜下观察细菌在体内的播散。分别收集感染后6、 8 10 12 14 16 24h Amikacin AMK 、 、 、 、 和 的斑马鱼进行阿米卡星 （ ， ）杀菌实验。 计数整条鱼感染的细菌量和侵入斑马鱼细胞内的细菌量，检测细菌在体内的繁殖 情况。 3 () 鼠伤寒沙门菌对斑马鱼感染模型自噬的影响 收集感染后6、8、10、12和14h 的斑马鱼，蛋白免疫印迹 （western-blotting， WB 1 3- microtubule-associatedprotein ）检测自噬标志蛋白—微管相关蛋白 轻链 Ⅱ（ 1lightchain3-Ⅱ，Lc3-Ⅱ）及自噬底物蛋白p62 的表达；透射电镜（transmission II 斑马鱼模型用于沙门菌质粒毒力基因spv对感染及自噬影响的研究 中文提要 electronmicroscope，TEM）观察斑马鱼小肠上皮细胞的超微结构。 4 Torin1 chloroquine CQ () 及氯喹（ ， ）对沙