甘油氧化酶高产株的筛选、酶的分离纯化及酶学性质研究.pdfVIP

摘要 摘 要 Oxidase，GLOX)在氧气存在的情况下，可将甘油氧 甘油氧化酶(Glycerol 化为甘油醛，同时产生过氧化氢。甘油氧化酶可以替代甘油激酶和甘油磷酸氧 化酶对血液中的甘油三酯进行测定。甘油氧化酶还可将乙二醇经由羟乙醛氧化 为乙二醛，可将乙醇酸氧化为乙醛酸。因为酶催化反应的速度快，无副产品产 生，如将其用于工业生产乙二醛和乙醛酸，具有广泛的应用前景。 日本曲霉(Aspergillusjaponicus)是半知菌纲的丝状真菌，是产生甘油氧 化酶的重要菌种。为了提高甘油氧化酶的产量，本研究首先利用根癌农杆菌 (Agrobacterium 了日本曲霉突变体文库，对该文库中的332株日本曲霉转化子进行甘油氧化酶 产量检测，筛选到4株产量提高的转化子，其中njyz0079较初始菌株As5999 甘油氧化酶产量提高了50％，摇瓶条件下Ajyz0079甘油氧化酶活力达到 10．02U。 对日本曲霉生产甘油氧化酶的摇瓶和10L罐体发酵条件进行研究。确定日 本曲霉生产甘油氧化酶的摇瓶发酵条件为：107个日本曲霉孢子接入已灭菌的装 罐体发酵条件为：109个孢子接种到灭菌后装有8L发酵培养基的10L发酵罐中， 8h。 30℃，风量450L／h，灌压0．03．0．04Mp，搅拌转速200r／min，发酵培养1 G．25凝胶色谱柱脱盐， 通过收集菌体，液氮研磨，硫酸铵沉淀，Sephadex HP离子交换层析和琼葡糖G．200 Q FF凝胶过滤层析对甘油氧化酶进行 HiTrap 了分离纯化，纯化后甘油氧化酶蛋白纯度达98．98％，比活达到38 U／mg。经 SDS．PAGE确定甘油氧化酶单体分子量为66kDa，推测其由六个分子量为66 kDa的亚基组成。 甘油氧化酶在以甘油为底物时，最适作用温度为37℃，温度对酶活力影响 9．0．9．5范围内稳定； 较大，随温度升高酶活力逐渐降低；最适pH为7．0，在pH Ca+、C02+、A13+和Mn2+对甘油氧化酶活力的抑制作用较明显；其‰值为 1 x104mmol／L·min～。 4．34mmol／L，‰为5．93 关键词：甘油氧化酶，ATMT，发酵，纯化 Abstract Abstract oxidize to without GlycerolOxidase(GLOX)canglycerolglyceraldchydes ofall callbe ina cofactor．The requirementexogeneous enzymeemployedspecific colorimetricforserum the and assay triglycerides，replacingglycerophosphatase OxidaseCallalsooxidize to glycerolkinase．Glycerol ethyleneglycolglyoxal， acidto acid thereaction