奶牛β-酪蛋白动子引导的乳腺高效定位表达载体的构建与筛选.pdfVIP

奶牛B一酪蛋白启动子引导的乳腺高效定位表达载体 的构建与筛选 中文摘要 【目的】 乳腺生物反应器具有巨大的市场前景，目前制约其产业化发展的主要原因之 一是对乳腺基因表达调控机制认识不足和缺乏可在乳腺高效、特异表达的载体。 本研究以湛江地区饲养的荷斯坦奶牛基因组DNA(gDNA)为模板，首先克隆出 B．酪蛋白5’．端的不同调控区序列和3’．端调控区序列，然后采用重叠PCR技术将 这些不同的调控区片段拼接，构建出分别剔除掉5’．端调控区内的负调控序列、 负调控序列和转座子序列重叠区、转座子序列等片段的6种重组p．酪蛋白启动 子，并对这一系列重组启动子的活性进行检测，从中筛选出活性最强的重组p． 酪蛋白启动子，用于进一步构建高效奶牛乳腺定位表达载体，为丌展奶牛乳腺生 物反应器的研究工作奠定基础。 【方法】 根据GenBankXl471l提供的奶牛B．酪蛋白基因序列设计引物，以荷斯坦奶 牛全血中提取、纯化的gDNA为模板，通过PCR扩增获取奶牛p一酪蛋白基因5’- 端及3’．端调控序列；设计12对重叠PCR引物，以5’．端调控序列为模板扩增出 分别剔除掉5’．端调控区内的负调控序列、负调控序列和转座子序列重叠区、转 座子序列等片段的6对p．酪蛋白基因5’．端调控区上下游调控片段，采用重叠PCR 技术将这6对上下游调控片段两两拼接得到6种结构不同的重组B．酪蛋白启动 子，并将它们分别定向克隆到含有荧光素酶报告基因的载体pGL3．Basic上，获 得6种含不同重组p．酪蛋白启动子的重组载体；采用脂质体技术将这些重组载体 分别转染至乳腺癌细胞MCF．7，通过原代乳腺细胞表达和双荧光素酶检测系统 检测这些不同结构的重组p．酪蛋白启动子在乳腺癌细胞MCF．7中引导荧光素酶 表达的效能。 【结果】 PCR电泳和测序鉴定结果表明，采用重叠PCR拼接技术成功构建出了分别 剔除掉5’．端调控区内所含的负调控序列、负调控序列和转座子序列重叠区、转 座子序列等片段而具有不同序列结构的6种重组p-酪蛋白启动子叩一1、叩一2、巾一3、 叩．4、巾-5和叩一6，并成功将它们分别克隆至pGL3-Basic载体中而获得了7种含 荧光素酶报告基因和不同结构的重组p一酪蛋白启动子的重组载体pGL3一印-1、 双荧光素酶报告系统分析测定结果显示，与天然的奶牛p．酪蛋白启动子0p．0 相比，重组p一酪蛋白启动子平一1、巾．2、叩．3、甲．4、叩-5、巾．6和op—O引导荧光 重组启动子印．5的表达效能最高。 通过插入SV40增强子的方法对表达效能最高的重组启动子甲．5的结构作进 一步的改造，获得了预期表达效能更高的重组p．酪蛋白启动子叩．5S和相应的重 组载体pGL3．rp．5S。 【结论】 成功构建了6种结构不同的重组奶牛p一酩蛋白启动子，其中重组p．酪蛋白 启动子叩．5的活性最高，其引导荧光素酶表达的活性是原始p．酪蛋白启动子op—O 活性的647％。成功将SV40增强子插入启动子甲．5获得了预期表达效能更高的 重组p-酪蛋白启动子叩-5S和相应的重组载体pGL3一叩·5S。 【关键词】B一酪蛋白，重叠PcR，启动子 2 Constructionand ofefjfjcientand Vector screening specificexpression cow whichwas recombinant by p-caseinpromoter guided Abstract 【ObjectiVe】 bioreactorhas wellmarket was M锄marygland promising prospect，howeVer’it not untilnow f．orthatthe