安全转基因油菜获得及其抗菌核病研究.pdfVIP

摘要 安全转基因油菜的获得及其抗菌核病研究 植物学专业硕士研究生唐巧 指导教师罗克明教授 摘要 油菜是我国重要的油料作物，菌核病作为油菜生产中最主要的病害，严重影 响着我国油菜的品质和产量，因此，控制油菜菌核病已成为当前油菜生产中亟待 解决的问题。尽管转基凶技术已在多种作物中取得了巨大的成功，但公众对转基 因作物生物安全性问题的日益担忧，明显限制了转基因技术在油菜育种中的应 用。 研究表明，来自益母草的抗真菌蛋白基因删脚2，经离体试验结果显示对 系统在烟草上的成功应用，消除了转基因植物中可能存在的生物安全性问题。故 在本研究中，我们将益母草脂质转移蛋白基因L阴魍搭建在“Ge鹏．deletor’删除 系统内并转化油菜，获得安全转基因油菜。本研究的完成，可望为转基因作物生 物安全性的控制提供一个应用于大田生产的技术手段。研究内容如下： l、含有抗菌肽基因删脚2的删除系统载体pBGP．FIJP．L1：P．GN的构建 扩增目的基因删MP2连接pCXSN载体，测序正确后，双酶切含目的基因 菌EHAl05得到植物表达载体EHAl05．pBGP．FLP．U甲．GN。 2、根癌农杆菌介导的油菜菜遗传转化及分子检测 以油菜品种中油82l的下胚轴作为转基因受体材料，利用根癌农杆菌介导法 转化来源于益母草的阳离子抗菌肽基因删脚2，由花粉特异性启动子基因BGP 两南入学硕十学何’沦文 果均呈阳性，初步证明外源目的基因已整合到油菜基因组中。RT-PCR证实 删脱P2和凡P基因分别在转删肋乃和转pBGP．FLP．GN油菜植株中均能大量表 达。 3、转删脚2基因油菜抗病性检测 体外抑菌试验表明，转L朋朋rP2基因油菜细胞粗提液对菌核病病菌的菌丝抑 制力明显强于非转基因油菜细胞粗提液。进一步将菌核病病菌接种在转基因和野 生型油菜叶片上离体培养，结果显示野生型植株叶片感病快且面积大，而转 删朋rP2基凶植株叶片仅少面积感病。显微镜下观察叶片体内病菌菌丝侵染情 况，发现菌核病病荫的菌丝在非转基因油菜植株中形态正常，而在转删膨P2基 因植株叶片中，菌丝变厚变粗，且表现为卷曲形态，在叶片内扩散速度和扩散面 积也小于非转基因植株叶片。上述抗性试验结果表明，在油菜中超量表达 删脚2基因能显著提高对油菜菌核病的抗性。 4、转pBGP．FLP．GN载体油菜删除效率检测 比较处于发育相同阶段的野生型花粉粒，以及转删朋n基因油菜花粉粒的 GUS组织化学染色结果，可初步证实在转pBGP．FIJP．GN基因油菜的花粉粒中已 实现基因删除。迸一步比较转pBGP．FIJP．GN基因油菜不同阶段花粉粒染色结 果，显示花粉粒颜色由蓝色逐渐朝黄色变化。对所有计数花粉粒进行数据统计， 结果显示转pBGP．FLP．GN载体油菜删除效率为82．51％。上述结果表明，含有 pBGP．FLP．GN载体的转基因油菜植株的删除效率较高，已达到一个明显的删除 效果。 关键词：油菜；L阴膨P2基因；基因删除；删除系统l抗病 Ⅱ Abstract Generationof oilseedwithout transgenicrape concernsand onitsresistanceto biosafety study — T ．● ● 1 ．● 6’CZP加以门Z以SCZP加以D厂“m M勾or：BotanyGraduate：QiaoTang Luo SupeⅣisor：Pro￡Kernjng Abstract iIl Oilseed