家蚕BmDicaete基因的克隆及功能初探.pdfVIP

摘要 家蚕B聊D记办口e纪基因的克隆及功能初探 细胞生物学专业硕士研究生：彭丽娜 指导教师：鲁 成教授 潘敏慧教授 摘 要 跏基因家族是一类重要的转录因子家族。自从1990年Sinclair等在人类和小鼠 中克隆了哺乳动物性别决定基因——睾丸决定因子艘】，／S幻叹seX-det即niningregion 0fⅥ基因后，一系列与之同源、编码转录因子的基因相继被发现，统称为滩因 家族。融基因家族是存在于动物个体中的与动物性别决定因子船惧有高度序列 相似性的一类转录因子家族，其特征是含有一个高度保守的与DNA结合相关的高迁 移率盒(1ligll 发育过程，在动物性别决定与分化、生殖腺发育、早期胚胎发育、神经系统发育、 软骨发生及血管发生等多种组织器官的形成过程中发挥着重要的生物学作用。 家蚕是鳞翅目昆虫的典型代表，是一类重要的经济昆虫，也是良好的模式生 物，但家蚕融基因的研究还处于起步阶段。Dfc概船基因属于融基因家族B亚族 基因，首先在黑腹果蝇中被发现，与哺乳动物中的融2同源性最高，自发现以来 即受到广泛的关注。该基因也是作为一种转录因子参与个体发育特别是个体神经 系统发育的调控，它还参与了个体后肠发育、卵母细胞形成等多种发育过程。 本文基于其他模式生物的先进研究成果及家蚕基因组信息，分析并克隆了果 蝇Dfc胁班基因的家蚕同源基因曰朋Df幽韶胞基因，并对其表达及功能进行了研 究，得到了如下研究结果。 l家蚕B朋Dfc肠P胞基因的克隆及序列分析 利用家蚕EST数据电子克隆了果蝇D肌Dfc向口e倌基因在家蚕中的同源体，定 点为9．89。通过结构域预测，编码蛋白的第39个氨基酸到第107个氨基酸之间， 有一个融基因家族的保守结构域HMG．box。基因组序列分析结果显示 l 两南大学硕士学何论文 B脚Dfc概纶基因完整的OFuF即为一个外显子，不含有内含子结构，这也同胁 基因家族B亚族基因的特点相吻合。同源性分析结果表明，砌D记施P胞基因在进 化上高度保守，与其脊椎动物及非脊椎动物中的同源基因在HMG-box结构域内 高度保守(≥90％)，在HMG．box区外也有一定的序列相似性；家蚕中鼢基因 成员之间在HMG-box区保守性约为50％，HMG-box区外基本无序列相似性。 2家蚕曰胍Dfc概纪基因的原核表达 由于砌Dfc肠已胞基因与亚族内的其它基因相比，它们在HMG-box区的序列 相似性达到了90％以上，为了研究方便，实验中我们表达了两段砌D纪J12韶把基 因的片段。根据砌D『cIIl口P胞基因的完整cDNA序列设计引物，体外克隆 B历D纠娩胞基因的Ol心及不含有保守结构域HMG．box的特异序列。将目的片段 序列亚克隆到pET-28a-C(+)表达载体，构建重组表达质粒，将该重组质粒转化到 白。由于加了组氨酸标签，目的蛋白大小分别为32．3kD和』l(D，与预测结果一 致。该蛋白以包涵体的形式存在。IPTG浓度和诱导时间对．砌D砌口P纶蛋白的表 ．达影响不大，但诱导温度会显著影响目的蛋白的表达量。本实验最终采用0．4mM IPTG、37℃诱导5h来诱导目的蛋白的表达。 ． 3家蚕BmDichaete蛋白抗体的制备 ‘‘‘‘’ 以纯化的BmDicllaete特异片段蛋白为抗原制备了抗体，并用饱和硫酸铵盐 一 析法纯化，通过间接ELISA法检测抗体效价为l：lo0000。 4家蚕砌Dfc概纪基因的表达模式分析 提取家蚕发育各时期和幼虫5龄3天各组织总RNA，利用l盯．PCR技术分析 砌D缸概饱基因在家蚕发育过程中的表达模式。研究发现砌D砌础胞在家蚕整 个发育过程中都有表达，蛹后期表达量降低，化蛾时基本不表达：砌Dfc概纪基 因在家蚕幼虫期的表达还具有组织特异性，主要在神经、头部、卵巢、后肠及丝 腺中表达。 提取家蚕胚胎发育各天的蛋白进行喊mblottiIlg分析，发现砌D记肠P胞