家蚕中肠细胞培及饲料成分刺激反应的研究.pdfVIP

中文摘要 中文摘要 人工饲料养蚕是蚕业生产的一项重大技术革新。目前，国内外主要采用活体家蚕进行人 工饲料配方及成分的物质能量代谢试验和饲养试验，但活体生物家蚕对饲料的适应性受季节、 温度、品种品系等因素的影响较大。若采用肠上皮细胞的原代培养物对人工饲料的配方及营 养效用进行评价研究，则可以避免上述影响。家蚕中肠是家蚕消化器官最发达的部分，它不 仅是消化吸收营养的场所，也是进行物质和能量代谢的重要器官。目前，在家蚕的组织研究 中，中肠的研究大多集中在物质代谢和细胞化学等方面，而中肠上皮细胞的原代培养及原代 培养物对外来刺激的反应还鲜有报道。家蚕作为一种模式昆虫．应用家蚕培养细胞进行理论 研究和生产应用倍受关注。虽然早在20世纪30年代，williamTmger就开始了家蚕细胞培养的 研究，但是到目前为止，仍没有家蚕中肠细胞系的研究报道，这主要是缺少理想的培养基和 ‘ 科学有效的培养方法，特别是成功的原代培养方法。 本实验的研究目的在于：制备可用于家蚕细胞培养的去细胞血淋巴液及家蚕组织匀浆液。 以家蚕中肠组织为材料进行原代培养，摸索原代培养的条件和方法．考察现行家蚕人工饲料 主要成分对中肠细胞增殖的影响，为家蚕饲料开发研究提供细胞水平的依据。并期望最终为 建立家蚕消化道细胞系，为药物药效的体外敏感性试验．提供前期实验铺垫。主要研究内容 及结果如下： ‘ 1．家蚕培养基及培养用液的制各 本试验通过离心、过滤、透析等方法，获得家蚕去细胞血淋巴液，并通过添加维生素C防 止酪氨酸酶氧化。制备得到的去细胞血淋巴液，呈淡黄色，透明状，稍有粘性，经测定pH值 为6．3士o．3，蛋白浓度为25．4rI彬100IllL。家蚕经去除头部、消化管、马氏管、肛门后，得到的 组织通过与PBS液混合匀浆，得到白色、透明状的家蚕组织匀浆液，经测定pH值为6．5±0．1， 蛋白的浓度为69．6m∥100nlL。 2．家蚕中肠细胞的培养及生长指标的检测 本试验以2．3龄眠期家蚕幼虫中肠组织为材料，分别以Gmce’s培养基和家蚕组织匀浆为基 础培养基，家蚕去细胞血淋巴液、胎牛血清、家蚕组织匀浆为辅加成分，配制6种不同营养成 分的培养基(①Gr虻e’s基础培养基+20％(V～)家蚕组织匀浆液；莲驷掀’s基础培养基+20％ FBS；⑤家蚕组织匀浆液+20％(VⅣ)家蚕去细胞血淋巴液；⑥家蚕组织匀浆液)；取家蚕后部 丝腺来源的丝素蛋白，制备成可供细胞生长的粘附材料l对中肠细胞进行原代培养，并对成 功传代细胞的生长状况、细胞生长曲线、细胞分裂指数、细胞接种存活率等相关指标进行检 测。通过对比不同培养基培养家蚕中肠细胞，发现以Gm∞’s培养基为基础，分别添加20％(VⅣ) 家蚕去细胞血淋巴液和胎牛血清的实验组，细胞能在原代接种培养的第25d，稳定生长，并在 70-75d，达到80％铺瓶率．传代培养后第45d，细胞达到80％铺瓶率。通过观察培养物主要由3 l 西南大学硕士毕业论文 种类型的细胞混合组成。分别为：呈扁平的梭型或卵圆型的细胞，单层生长，边界清晰；另 一类细胞呈长梭型，中央有卵圆形核，排列整齐。同时还有少量的细胞呈纺锤形。通过对Gmcc’s 代细胞的生长曲线和接种存活率的测定发现，第一次传代培养的细胞生长缓慢，接种后有7．10d 的潜伏期，从2245d和20．39d分别是这两组细胞的对数生长期。在45d和39d时，两组细胞浓度 达到顶峰，达到80％铺瓶率。在其余3种完全培养基中，未观察到细胞。 3．人工饲料成分对中肠细胞的刺激反应 为进一步探讨家蚕人工饲料中原料的安全指标，以生长对数期的中肠细胞为对象，用不 同的饲料成分原液刺激细胞，测定其对细胞增殖的影响。不同比例的桑叶汁(40％、20％、lO％、 0．001％)的细胞增殖试验结果表明，桑叶各比列原液刺激细胞后平均细胞相对增殖率都大于 90％，没有细胞毒性。脱脂大豆的浓度在2．5％以下，蚕蛹蛋白的浓度在5％以下，能保持细胞 的增值活性。对于山梨酸、丙酸钙浓度大于2