安丝菌素后修饰安莎类抗生素聚酮链的释放.pdfVIP

摘要 莎霉素(ansamycins)，对多种肿瘤细胞株具有显著的抑制活性。该化合物生物 合成机制和复杂的后修饰反应已经得到了深入的研究。本文主要对安丝菌素生物 合成后修饰中的口甲基转移酶(Asm7)以及安莎类抗生素聚酮链释放与环化机 制两个方面开展了相应的工作。 第一部分的研究内容主要是关于D-甲基转移酶(Asm7)后修饰顺序。通过 基因缺失与回补实验确定了基因asm7编码的蛋白是负责安丝菌素C．20位羟基的 甲基化。基因asm7突变株在液体和固体YMG培养基中分别产生T20．氧，氮．二去 甲基安丝菌素P．3和20．氧．去甲基安丝菌素P．3，并通过核磁共振进行了相关化合 物的结构鉴定。生物信息学分析显示Asm7属于孓腺苷甲硫氨酸(SAM)依赖的 II型甲基转移酶家族。利用大肠杆菌异源表达的Asm7天然活性蛋白以二聚体的形 式存在，单体的分子量大小为41kDa。通过相应突变株的大量发酵得到了需要的 底物，并以SAM和19．氯代原安丝菌素为底物，确定了Asm7的最适反应温度为 35C，最适pH为8．0，最佳金属离子为5mM的MgCl2。另外，通过比较Asm7对原 安丝菌素、19．氯代原安丝菌素和20．氧，氮．二去甲基．脱氧美登木醇三种底物的体 外酶促反应动力学差异的分析，确定了D．甲基转移酶(Asm7)在安丝菌素后修 饰中的确切催化顺序。 第二部分是关于安莎类抗生素聚酮链释放与环化。从生物合成角度分析，安 莎类抗生素由I型聚酮合酶催化形成。在典型的I型聚酮合酶的C末端存在一个 属于oel3水解酶超家族的硫酯酶TE结构域，负责催化分子内或分子外的亲核反 应实现聚酮链的释放。前期研究发现，安莎类抗生素生物合成基因簇中负责聚酮 链释放的蛋白是由芳胺Ⅳ-乙酰转移酶家族的酰胺合酶基因编码，与硫酯酶有较 大的差异，代表着一类新颖的聚酮链释放和成环机制。本论文采用安丝菌素、萘 霉素、利福霉素、格尔登素等产生菌为研究材料开展了相应的工作。首先，利用 体内基因突变与互补实验验证了酰胺合酶基因对于安莎类化合物合成的必要性， 同时也发现了安莎类抗生素之间的酰胺合酶基因没有功能互补性；其次，通过末 端ACP的置换实验以及细菌双杂交实验考查了末端ACP与酰胺合酶之间的关 系；最后，为了进一步的明确酰胺合酶的催化机制，利用大肠杆菌作为表达宿主 对其的进行了异源表达。接下来将会利用化学合成底物进行体外酶催化分析、定 点突变确定其关键氨基酸特征，以及考察酰胺合酶和聚酮模块末端酰基载体蛋白 之间的关系等方面工作，一来阐明酰胺合酶对安莎类抗生素释放和环化的机制： 关键词：安丝菌素，安莎霉素，D-甲基转移酶，酶促反应动力学，异源表达， 酰胺合酶 Ⅱ ABSTRACT memberof 19-membered lactamwith Ansarnitoein，aansamycins，is macrocyclic antitumor isassembledon I modular extraordinarilypotent activity,which type mechanismand of biosynthetic polyketidesynthases(PKSs)．The post-modification ansamitocinshasbeen dissertationfocusesonthe deelyinvestigated．This mainly of the ofansamitocin catalyticsequenceO—methyltransferase(Asm7)inbiosynthesis andthe