未培养微生物延索酸水合酶基因的克隆、表达及酶学性质鉴定.pdfVIP

未培养微生物延胡索酸水合酶基因的 克隆、表达及酶学性质鉴定 摘要 延胡索酸水合酶，又称延胡索酸酶伽m口朋纪咖伽P，E．C4．2．1．2)， 是催化延胡索酸转变成L一苹果酸的一类酶。L一苹果酸在食品、医药、印染 和建筑等行业上有特殊的用途。近几年来具有高度耐热活性产延胡索酸酶 6陀v浏，被广泛应用于以延胡索酸作底物生产L一苹果酸。但是目前天然发 酵菌种在工业生产中存在着延胡索酸水合酶活力不高或者受天冬氨酸转氨 酶干扰的难题。宏基因组学技术绕开了“纯培养”的技术瓶颈，使得人们 在基因组水平上直接开发利用各种环境中丰富的微生物基因资源成为现 实。本实验室利用宏基因文库技术，构建了广西北部湾海洋沉积物文库。 利用活性筛选和直接测序相结合的筛选策略，得到了一种编码延胡索酸水 合酶的新型酶基因(屈川F)。生物信息学分析结果表明，在氨基酸水平上和 一种来自于B“r砌D枕r缸(伯克氏菌)菌属的延胡索酸水合酶同源性为27％， 一致性为4l％。利用PCR定点扩增技术扩增目的基因，与表达质粒加馏觑争2 连接，导入表达宿主细胞砚2，伊Ei2p厶)z好，构建了重组表达克隆 p6蚴嬲566G脱2J伊E31忉勾馏．S。SDS—PAGE蛋白电泳结果表明，目标诱导 蛋白大小为60kDa左右，与生物信息学分析结果基本一致。本工作为进一步 研究新型延胡索酸水合酶F瑚心的生化功能奠定了基础。 T ．屈mF编码的基因产物主要研究对象，对其进行了酶学性质的初步研究，发 现正向反应最适pH值8．5，最适作用温度55℃的条件下，逆向反应受pH值及 温度影响比较小。以延胡索酸及苹果酸分别作为底物，得出FumF重组蛋白 u 为O．5228mM，最大反应速度为54M／min，转换数Kcat为9．085min一， 反相反应I(IIl值为4．33 min～。 mM‘1 正相反应的Kcat依m值为17．4 mM。1 为6．01 min～。平衡常数Kq为61．604。 关键词：延胡索酸水合酶L一苹果酸宏基因文库 Il UNC唧UREDMICROORGANISMSFI】-MARASE GENE EXPRESSIONAND CHONING BIOCHEMICALCHARACTERIZATl0IN ABSTRACT Fumarate known the hydratase，alsoas如marase(EC4．2．1．2)，iscatalytic 如marateintoL-malicacid．L-malicacidcan inthefieldsof be印plied food， and andotherindustries．Inrecent medicine，printingdyeing，buliding years， a of suchas producinghi曲lyheat—resistant乃聊口膦Pmicroo唱anisms， i11 B陀Vf6口c纪f优聊砌V甜垅and三口c幻6口c川淞hasbeen used