未培养微生物预酸脱氢酶基因的克隆、表达和功能鉴定.pdfVIP

未培养微生物预苯酸脱氢酶基因的克隆、表达和功能鉴定 摘 要 预苯酸脱氢酶(EC 生成对羟基苯丙酮酸，在L．酪氨酸的生物合成代谢中起关键作用。目前国 aeolicus、 际上有关预苯酸脱氢酶的研究主要集中在对来自于Aquifex Streptococcusmutans和Haemophilusinfluenzae等细菌的预苯酸脱氢酶的功 能和结构研究，鲜见有关来自于环境未培养微生物的新型预苯酸脱氢酶的 研究。 本研究采用基于序列特异性直接测序的策略，筛选本课题组前期构建 带的外源DNA片段中可能包含一个编码预苯酸脱氢酶的新基因，将其命名 kDa， 码具有一个具有203个氨基酸残基的多肽；其相对分子质量约为22．3 于Zymomonas 似性最高，相似性为65％，一致性为42％。 采用pETBlueTM系统构建了包含肋E基因的重组表达克隆，采用镍柱亲 和层析技术纯化得到了重组蛋白PdhE。基因的功能鉴定实验结果发现重组 蛋白PdhE没有预苯酸脱氢酶的催化活性。结合简单组件结构分析结果，初 步推测预苯酸脱氢酶的氨基末端的Rossmannfold结构是预苯酸脱氢 p一0【．p 酶的体现催化活性时的必需关键组件，其作用可能是帮助辅酶在活性中心 定位。 基于序列多重序列分析比较结果，采用融合PCR技术，将大肠杆菌K．12 菌株中编码预苯酸脱氢酶的“Rossmann p一仅一p 基因的功能鉴定实验结果表明重组蛋白PdllE一1恢复了预苯酸脱氢酶活性。 生化性质分析实验结果表明，以预苯酸为底物，重组蛋白PdhE一1的最适反 U／mg。 应温度为45℃，最适反应pH为8．O；重组蛋白PdhE一1的比活力为7．63 动力学参数分析结果表明，重组蛋白PdhE．1的表观米氏常数‰为O．87 0．08 3mmol／L。还发 mmol／L，催化常数‰at为1S～，对辅酶NAD+的％为O．1 0mmol／L)对目标蛋白没有抑制作用。 现代谢终产物L．酪氨酸(1 本研究有关编码预苯酸脱氢酶的新基因的功能鉴定结果为L一酪氨酸生 产菌株的改良中具有重要的技术参考价值；在进一步利用其生化特性作为 可能的新药研发的靶酶研究中具有重要参考作用。 关键词：预苯酸脱氢酶L．酪氨酸 未培养微生物宏基因组文库镍柱亲和 层析技术 GENE AND CLONING,EXPRESSION oFAPREPHENATEDEHYDRoGENASEFRoM UNCUl月UREDSoIL MICROORGANISMS ABSTRACT Prephenate 1．3．1．1 theoxidative dehydrogenase(EC 2)catalyzes of to inthe of decarboxylationprephenate 4-hydroxyphenylpyruvatepresence a roleinthe metabolism． NAD(P)十，wh