泥鳅生长激素基在毕赤酵母中的表达.pdfVIP

lIIII I[IIIIIIIIIIII IIl Y1 734408 摘要 hormone，GH)是所有脊椎动物包括鱼类维持正常的生长和发育所 生长激素(growth 必需的一种单链多肽激素，在机体的生长和发育过程中起着重要作用。具有促进脂类降 解，加速蛋白合成等作用。天然鱼体中GH含量低，许多研究证实，重组生长激素具有 天然生长激素的功能，因此，为了得到大量具有生物活性的重组生长激素，本论文成功 将泥鳅生长激素基因(MisgurnusAnguillicaudatus 体，并实现在毕赤酵母(Pichiapastor)的分泌表达。 以成体泥鳅脑垂体中提取的总RNA为模板，用RT-PCR方法扩增并克隆eDNA， I酶切位点，下游 根据MaGH两端序列改造，设计一对特异性引物(上游引物加入EcoR 引物加入NotI酶切位点)扩增了泥鳅的GH成熟肽cDNA。将获得的泥鳅生长激素基因 表达片段，经酶切后连接到能够获得高拷贝数，并含有酵母相应信号肽的pPIC9K表达 载体中，转化大肠杆菌DH5 PCR方法筛选阳性克隆，用EcoRI和NotI酶切鉴定重组质粒。测序表明MaGH正确插 入Q分泌信号开放读码框的下游。再将获得的pPIC9K．MaGH重组子线性化处理，经氯 化锂转化组氨酸缺陷型毕赤巴斯德酵母GSll5，转化后的酵母菌株经MD培养基筛选阳 性重组子，提取转化子基因组DNA，用基因组PCR鉴定重组菌株。将这些克隆用诱导 表达培养基BMMY诱导，取上清进行SDS．PAGE分析，结果表明，在上清中检测到 的pH值实验表明，最适pH值为6．0。将重组工程菌投喂泥鳅鱼苗，实验鱼的体重和体 长明显高于对照组，达到显著性差异，实验初步显示分泌表达的MaGH具有促进泥鳅生 长作用。 本研究克隆到了泥鳅GH基因成熟肽的eDNA序列，并成功构建了真核表达载体， 实现了泥鳅重组GH蛋白的高效表达，为进一步开展其应用和生物活性检测分析及研制 新型鱼类生长饲料促进剂奠定基础。也为下一步进行产物纯化及其物学功能研究奠定了 基础。 关键词：泥鳅生长激素，毕赤酵母(Pichiapastoris)，分泌表达，促生长作用 ■ ABSTRACT an in and Growthhormon essentialrolethestimulationofsomatic plays growthdevelopment．GH b*=nlaalleethe rateandfeedconversion of GHis low． fish．However,nativeextremely growth efficiency as thatrecombmantfishGhshavethesamefunctionthenativeones．To Fortunately,Itproved producelarge mountof forfurtheruse．this biologicalactivity M／sgurnu