甘蓝染色体图谱构建及SI基因的定位研究.pdfVIP

摘要 甘蓝染色体图谱的构建及SI基因的定位研究 生物化学与分子生物学专业博士研究生 王永 指导教授 朱利泉教授 摘要 荧光原位杂交是一种有力的细胞遗传学研究工具，现广泛应用于基因的定位、染色体结 构的研究、细胞遗传图谱和染色体图谱的构建。甘蓝作为芸薹属三个基本种之一，也是芸薹 属基因组计划研究对象之一，冈此，利用荧光原位杂交技术，构建甘监的染色体图谱以及细 胞遗传图谱，直观地展现基因、分子标记等在染色体上的具体位置，成为甘蓝分子细胞遗 传学研究的主要内容。同时，自交不亲和作为甘蓝防止白交的一种重要生殖隔离方式，其 信号传导途径除受一个带有复等位基冈的多态性s位点(S．10cus)控制外，还与另一些信号 传导元件(舰尸K、ARCl、SSP等)密切相关。但是，关于这条信号传导途径相关元件编码 基冈与S位点之间的连锁关系、以及它们在甘监染色体上的具体位置分布情况还有待研究。 本研究以自交不亲和甘监为材料，采用荧光原位杂交技术，将重复序列5SrDNA、标记位点 旨在构建甘监染色体图谱以及细胞遗传图谱，明确白交不亲和基因在染色体的具体位置及连 锁关系，这对芸薹属基冈组计划和自交不亲和的机理研究具有非常重要的意义。 主要研究结果如下： 1． 靶DNA载体的制备：利用甘蓝的根尖、花蕾、以及幼叶，成功地制备出不同伸长度的 靶DNA载体，包括甘蓝根尖和绒毡层细胞的中期染色体、粗线期染色体和伸展DNA纤 维。 A．甘蓝根尖中期染色体制备：在暗培养条件下采用变温同步化处理根尖，明显提高了 mol／L 根尖细胞中期分裂相；根尖预处理采用的是0．002 8．羟基喹啉预处理1h，获 得了最佳的效果：2％纤维素酶和2％果胶酶混合液在37℃水浴锅中酶解约40。90 min，并进行前后低渗，可以获得分散良好、背景较低的根尖中期染色体分裂相； B． 绒毡层细胞中期染色体以及粗线期染色体的制备：以田间采取的花蕾为材料，70％ 乙醇中．20℃保存备用，保存时问在3个月内：选取具有理想分裂相的花药，在2％(w／v) min，可以获得染色体分散、背景 纤维素酶和2％(w／v)果胶酶的混合酶液中酶解60 较低的染色体制片； I 两南人学博十学1=奇：论文 C．伸展DNA纤维的制备：采用匀浆法获得分布均匀、杂质较少、密度适中的细胞核； 采．}{J分子梳理法制备山伸展度良好、密度合适以及平行的DNA纤维。 2． FISH体系的建立：通过荧光原位杂交相关参数的探索，建立了适合不同伸长度的靶DNA 载体FISH体系。对中期和粗线期染色体制片采用相同的处理步骤，而DNA纤维制片无 需进行蛋白酶处理和预变性。 A．片子的预处理：100 A379C处理1h可以增强杂交的信噪比；500 l上g／mL的RNase min可以有效的去除蛋白质；70％去离子甲酰胺中 ug／mL胃蛋白酶在37℃处理40 70℃变性2min可获得较好的杂交效果。 B． 杂交混合液组成：去离子甲酰胺50％；硫酸葡聚糖7．5％：2×SSC,1．5ng／／,L探 针；0．5％SDS；0．5／zg／／zL鲑鱼精DNA。 C．洗脱条件：重复拷贝基因，洗脱温度42℃，洗脱时间8min；低拷贝或单拷贝基因， 洗脱温度37℃，洗脱时间5mira如果靶DNA为DNA纤维时，洗脱温度40℃，洗 脱时间5min。 3． 甘蓝根尖中期染色体的核型分析：甘蓝体细胞染色体数2n=18，其核型公式为 9号染色体为近中部着丝粒染色体：7号染色体的短臂末端具有随体；甘蓝的核型属丁 2A型，即对称型核型。