《实验七血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳》.doc

实验七 血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳（6学时） 1目的 了解聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理和操作技术。 2原理 聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，是由丙烯酰胺单体和少量交联剂在催化剂和加速剂的作用下发生聚合反应而制得的。聚丙烯酰胺凝胶电泳利用电泳和分子筛的双重作用分离物质。 聚丙烯酰胺凝胶具有网状结构，其网眼的孔径可用改变凝胶液中单体的浓度来加以控制。一般分离蛋白质选用7.5％聚丙烯酰胺凝胶，分离比较大的分子，如核酸时则用2.5％凝胶。凝胶电泳分辨力较高。 垂直平板电泳有以下优点：①一系列样品能在同一块凝胶板上进行电泳，显色条件也相同；②平板表面大，有利于凝胶的冷却；③易于进行光密度扫描测定。垂直平板电泳可用于分析和制备蛋白质、核酸等样品。 3器材 电泳仪，垂直平板电泳槽，染色与脱色缸，量筒50mL，滴管，250mL烧杯，玻璃棒，100ul移液枪 4试剂（同课本P228～229） （1）2%琼脂 （2）贮液1：1mol/L盐酸48.0mL/100mL, Tris 36.6g/100mL, TEMED 0.23mL/100mL.(pH 8.9) （3）贮液2：Acr 28.0g/100mL, Bis 0.753g/100mL. （4）贮液3：过硫酸铵 0.14g/100mL. （5）贮液4：1mol/L 盐酸48mL/100mL, Tris 5.98g/100mL, TEMED 0.46mL/100mL. (pH6.7) （6）贮液5：Acr 10.0g/100mL, Bis 2.5g/100mL. （7）贮液6：同贮液3. （8）贮液7：蔗糖40.0g/100mL. （8）电极缓冲液 6.0g Tris和28.8g甘氨酸混合加水到1000m1，用时稀释10倍 （9）0.05％溴酚蓝 （10）20％甘油 （11）7％乙酸 5操作步骤 （1）垂直平板电泳槽的安装：参见图11 将两块平板玻璃洗净晾干，并正确安装到U型槽内；将安装好玻璃板的U型槽安装到电泳槽中，并对称旋紧螺丝，注意要均匀用力；用电炉加热2％琼脂糖溶液，并用胶头滴管加到U型槽底部的两块玻璃板的缝隙内；将电泳槽倾斜放置，待琼脂糖冷却凝固后（约10分钟），将电泳槽扶正。 （2）凝胶的制备：参见图12 ①分离胶的制备： 按照课本P228添加试剂，其中过硫酸铵催化剂最后加，边加边摇晃，且配好后立即加入电泳槽，以免在烧杯中凝固；加入分离胶后，立即加入少量的水覆盖分离胶液面；待分离胶凝固后（30～60分钟），用滤纸条小心吸取表面水分，切不可碰到分离胶。 ②浓缩胶的制备： 按照课本P228添加试剂，其中过硫酸铵催化剂也要最后加，边加边摇晃，且配好后立即加入电泳槽，以免在烧杯中凝固；浓缩胶要加满两块玻璃板中间的槽，然后立即插入梳板；待浓缩胶凝固后（30～60分钟），再小心拔去梳板。 （3）加样： 将电极缓冲液分别倒入上下电泳槽（负极加至没过较低的一块玻璃板，正极加至电泳到一半），先用移液枪冲洗疏孔，再分别吸取20 微升小心加入疏孔。 （4）电泳： 接通电源，调节电压为300 v，待指示剂移至凝胶下端时（约2小时），切断电源。 （5）染色： 把垂直平板电泳槽上的玻璃轻轻扳开，将凝胶取下，放入染色缸内染0.5分钟，然后放入7％醋酸中脱色至背景脱尽为止。 （6）扫描鉴定： 根据染色所出现的区带，分析样品的组分。