Tim-3对H.pylori作用的鼠源性巨噬细胞内TLR4信号通路的影响.pdfVIP

摘要 摘要 背景及目的： 重要作用，其中巨噬细胞不仅担任着固有免疫反应的角色，而且能影响适应性 免疫反应。TLR4是种模式识别受体，能识别病原相关分子模式来激活巨噬细胞， 导致大量炎症因子的分泌，启动并调节机体免疫反应。Tim家族是新近发现的一 类跨膜蛋白家族，Tim．3是其中重要一员，研究表明它是区别Thl和Th2细胞的 标志分子，Tim．3信号通路激活后能下调Thl细胞反应。大量研究表明Tim．3在 固有免疫细胞如巨噬细胞上也有表达，且能通过TLR4信号通路对巨噬细胞功能 产生影响。目前H．pylori对巨噬细胞Tim．3及TLR4信号通路的影响尚未见报道， 因此，本文研究了H．pylori对Tim．3过表达巨噬细胞内TLR4信号通路的影响， 及相关疾病提供实验依据。 方法： (1)tt．pylord对巨噬细胞增殖的影响 细胞，实验分组如下： 对照组：未加细菌作用 A组：细菌与细胞MOI值为25 B组：细菌与细胞MOI值为50 C组：细菌与细胞MOI值为100 D组：细菌与细胞MOI值为200 E组：细菌与细胞MOI值为400 F组：细菌与细胞MOI值为800 分别培养3、6、12、24、48小时检测细胞增殖情况。 (2)丘pylord对巨噬细胞Tim一3、TLR4、MyD88表达的影响 以不同MOI的HpSSl作用小鼠巨噬细胞，实验分组如下： 对照组：未加细菌组 A组：细菌和细胞MOI值为25 lI 摘要 B组：细菌和细胞MOI值为50 C组：细菌和细胞MOI值为100 D组 ：细菌和细胞MOI值为200 细菌与细胞培养12小时后收集细胞。 (3)Tim-3重组真核表达质粒的构建、鉴定 ①分离小鼠脾脏单个核细胞，设计针对Tim一3基因的特异性引物并扩增目 的基因。 增、提取重组质粒，并采用酶切和测序鉴定。 (4)Tim-3重组真核表达质粒的真核表达 观察有无荧光及荧光强度，并收集细胞检测Tim-3mRNA及蛋白表达。 胞因子分泌的影响 @Tim-3基因转染 ②实验分组 以HpSSl(MOI=100)作用小鼠巨噬细胞，实验分组如下： 对照组1：细胞+转染试剂 对照组2：细胞+转染试齐U+Tim-3质粒 对照组 细胞+转染试剂+空质粒 实验组 细胞+转染试剂+丘pyJori i 实验组 细胞+转染试剂+T m一3质粒+丘py]ori 实验组 细胞+转染试剂+空质粒+丘pylori 丘py]ori作用12d,时后收集细胞和培养上清。 (6)检测方法： ①采用MTT法检NY．pylori对巨噬细胞增殖的影响 mRNA的表达 ②采用RT—PCR的方法检测各组细胞p勺Tim-3、TLR4、MyD88 ③采用Western B pNF—Kp65的表达 研究结果： TII 摘要 (1)lt．pylori对巨噬细胞增殖的影响 丘pylori作用3小时和24小时各组间细胞增殖率无统计学差异，6小时、 12小时和48小时各组间有显著的统计学差异(P值均0．01)。6小时各组细胞 增殖率随着MOI值的升高而升高，其中D、E和F组显著高于对照组(P0．05， 48小时各组细胞增殖率随着MOI值的升高而逐渐降低，B、C、D、E和F组均 0．01)，E和F组均显著低于D组(PO．05，P0．01)。 mRNA表达的影响 (2)H．pylori对巨噬细胞Tim．3、T