Ⅰ利福霉素SV生产菌株U-32谷氨酰胺合成酶的转录调控%3bⅡ抗乙型肝炎病毒药物的筛选.pdf

I利福霉素SV生产茵株u一32 谷氨酰胺合成酶的转录调控 摘要 谷氨酰胺是细菌进行生物合成反应的重要氮供体，为嘌呤、嘧啶 等化合物的合成提供氮素，谷氨酰胺合成酶催化谷氨酸和氨反应形成 谷氨酰胺，是细菌氮同化途径中的关键酶之一。 级代谢调控发生变化，揭示其调控机理对于指导利福霉素生产具有重 要意义。地中海拟无枝菌酸茵u．32中谷氨酰胺合成酶(Gs)是利福霉素 生物合成过程中的关键酶，GS的调控主要位于转录水平，受到氮源的 P2。 域存在两个启动子glnAP1和glnA实验表明在glnA翻译起始位 含有一对同向重复序列和一个反向重复序列，可能为一顺式调控元件 element (cis-actingo在以上工作基础上，本研究对GS在转录水平上 的转录调控机制进行了深入的研究。、跌得了以下结果： 1．将地中海拟无枝菌酸菌U．32 gtnA的启动子及其上游区域从5’端 双加氧酶，使无色的儿茶酚氧化成黄色的2一羟基一己二烯二酸半 粒转入变铅链霉菌(S 化子为零对照，测试不同质粒转化子在不同氮源条件下儿荼酚双加 氧酶的酶比活，结果表明：(1)在不同的氮源条件下，该酶的酶比 活为0．2％谷氨酸钠0．4％谷氨酰胺z0．2％硝酸钾》0．2％硫酸 铵，显示glnA的启动子片段确有启动活性，并受到氮源的调控。 在以谷氨酸盐为唯一氮源的条件下，该启动子有非常高的表达，当 以铵盐为唯一氮源时，该启动子的表达被强烈地抑制。这种调控方 式与在地中海拟无枝茵酸菌u一32中宏观观察到的谷氨酰胺合成酶 所受的调控方式有所不同。酶学分析表明，当u．32的生长以硝酸 钾为氮源时GS的表达量最高。但这两处调控的共同之处是都受到 glnA启 P2，它们独立工作 动子区域中所含有的两个启动子glnAP1和glnA 时均只有很弱的启动活性，而同时包含glnA P1和glnA P2的450bp 整的启动活性，且在BamHI位点上游的区域没有强的顺式调控元 件存在。 2．将ptL370质粒转入天蓝色链霉菌(S 白glnR的结构基因被突变而导致谷氨酰胺合成酶不能正常表达) 中，测试在不同氮源条件下报告基因j0IE的酶活，结果在J1508的 转化子中可以检见母压的酶活但在Fslo中则检测不到，这表明地 中海拟无枝菌酸菌u．32 glnA启动子的表达需要glnR样的正调控蛋 基因有较强的Southern blot杂交信号，说明u．32的总染色体申存 retardation 在与glnR基因高度同源的基因。叉经体外Gel assay测试， 结果显示J1508的细胞粗提物中存在与U．32 glnA启动子探针结合 的物质而在FSl0的细胞粗提物中未发现。这一结果证明glnR这一 正调控蛋白对于u．32 起着重要的作用。 3．本研究又用PCR的方法将地中海拟无枝菌酸菌U．32 glnA启动子中 retardation 和U．32细胞粗提物温育，Gel assay结果显示含有这30bp 为与反式调控蛋白相结合的顺式调控元件。又将去除了这30b