《结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统 maz EF6缺失突变株的构建及其表型的初步探讨2016年论文》.pdfVIP

· 180 · 微生物与感染 JournalofMicrobesandInfections，June25，2015，10(3)：180．185 http：／／imi．fudan．edu．cn · 论 著 · 结核分枝杆菌毒素一抗毒素系统 mazEF6缺失突变株 的构建及其表型的初步探讨 申爱平，曹帅丽，邢建新 ，袁俐 石河子大学医学院病原生物学与免疫学教研室 ，石河子 832002 摘 要：为构建结核分枝杆菌毒素一抗毒素系统 mazEF6缺失突变株，并对其表型进行初步探讨 ，首先用聚合 酶链反应 (PCR)分别从 H37Rv标准株和PUC．19K质粒扩增出mazEF6基因的同源臂及卡那霉素抗性基因 kan；然后应用融合PCR技术将 mazEF6基因的同源臂与 kan基因进行杂交拼接 ，获得 目的融合片段 ，将该 融合片段克隆于pMD．19T(simple)载体形成 自杀质粒 pMD．19T-z3rnazEF6．kan，并将 自杀质粒转化至大肠埃 希菌DH5a中；最后利用电穿孔技术将 自杀质粒电转至H37Rv标准株中，在卡那霉素抗性改良罗氏培养基上 筛选 H37RvzSmazEF6缺失突变株单个菌落，提取阳性菌株全基因组 DNA为模板，PCR扩增克隆片段并测 序。将所获得的H37Rvz3mazEF6缺失突变株进行遗传稳定性检测后 ，对其表型进行初步研究。结果显示 ， 该缺失株在 15代内未发生回复性突变；与野生株相比，缺失株生长速度缓慢且细菌形态短小。本研究证实， 融合 PCR技术便于快速获得结核分枝杆菌缺失突变株；结核分枝杆菌在缺失毒素．抗毒素系统 mazEF6基因 后生存能力下降，这为进一步研究毒素．抗毒素系统的作用奠定了基础。 关键词：结核分枝杆菌；毒素 抗毒素系统；缺失突变株 Construction and characterizati0n of toxin—antitoxin system mazEF6 deletion inM ycobacterium tuberculosis SHEN Ai—Ping，CAO Shuai-Li，XING Jian-Xin，YUAN Li DepartmentofPathogenicBiologyandImmunology，School Medicine，ShiheziUniversity，Shihezi832002， China Abstract：Tostudy thetoxin．antitoxin system m,azEF6 ofMycobacterium tuberculosis (M ． tuberculosis)， deletionmutantswereconstructedandsubjectedtophenotypeanalysis．First，theflanking(homologyarms) ofmazEF6 genefrom H37Rv andkanamycin resistancegene (kan gene) from plasmidPUC一19K were amplifiedbypolymerasechainreaction (PCR)respectively．Second，fusionPCR wasusedforthehybrid splicingofmazEF6homologyarmsand c／an gene，andthedesiredfusion fragmentwasobtained．Thenthe fragmentwasclonedintopMD．19T (simple)vectortoform asuicideplasmid (pMD一19T—AmazEF6一kan)， andthesuicideplasmidwastransformedintoEscherichiacol (E．col)DH5a．Atlast，theconstructed plasmidwastransformedintoH37Rvbyelectroporation．SinglecoloniesofM ．tuberculosiswerescreened onL—Jmedium with kanamycin，thegenomicDNA ofpositive strainswere extracted，and the targeted fragmentswereamplifiedbyPCR andsequenced．Thegeneticst