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PI辽PA脚ION
OF
PlARTICLESOFRHDV
AND
CONSTRUCTIONTHE
OF
EXPRESSIONcDNALIBRARY
OF
RK13CELLS
Yi
Candidate：Song
Supervisor：Pro．Liu
Guangqing
Discipline：Zoologe
of Science，
CollegeChemistryLife
Normal 321004
Zhejiang University,Jinhua
2010
May
达型文库的构建
摘要
兔瘟是对养兔业造成最大危害的一种重要病毒性传染病，具有高度接触性致死性。
其病原体是兔出血症病毒(Rabbit Disease
HemorrhagicVirus，RHDV)，属于杯状病毒科
种动物和人类疾病。杯状病毒侵入宿主细胞是病毒进行感染的首要环节，杯状病毒首先
需要与受体结合，之后通过细胞内吞作用进入细胞。关于杯状病毒的细胞受体，目前只
在少数几个种属中获得了一定的进展，但关于RHDV的细胞受体仍是一片空白。为了
筛选和鉴定RHDV的细胞受体，我们利用杆状病毒表达系统表达了RHDV的衣壳蛋白
(VP60)，纯化获得了病毒样颗粒(Virus．1ike
了RHDV的宿主细胞_RKl3细胞的eDNA真核表达文库。
1．RHDV
JX／97分离株VLPs的制备
转化DHl0Bae后发生转座，通过“三抗”板和蓝白斑法筛选到阳性克隆后，提取重组
Baemid
DNA，转染Sf9细胞，6天后收集上清，用上清重新感染新的Sf9细胞，依次感
染细胞2次。待Sf9细胞发生明显病变时，收集上清即为重组杆状病毒，取部分用于检
测或扩大培养。间接免疫荧光和WesternBlot检测结果表明重组蛋白在Sf9细胞中正确
表达，进一步的电镜观察显示重组病毒感染的Sf9细胞内以及纯化的重组蛋白都能自我
组．装形成VLPs。
2．RHDV
JX／97分离株宿主细胞RKl3
eDNA真核表达文库的构建
IV
离纯化获得mRNA。利用SMART技术，即以SMART
3’末端加上一段序列，再利用CDSIII／3’PCR
切后过柱分级收集dseDNA，选取大片段ds
eDNA(500bp)，核酸沉淀后克隆到聊I
KV200Q25心，电转化至
酶切的真核表达载体pEXP．Lib中。最后，利用电转仪1．8
2．55x105
CFU，随机挑取16个克隆，用合成的载体上的测序引物PCR扩增，发现插入
的eDNA片段大小在400-2250 Kb。以上结果表明，
bp之间，插入片段的平均长度约1．0
病毒样颗粒；
R
PREPAATIONOFⅥRUS．LIKEPAI之TICLESOFR皿V
ANDCONSTRUCTIONOFTHEEXPRESSIONcDNALIBRARY
OFRKl3CELLS
Abstract
Rabbit diseas
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