脱落酸（ABA）结合蛋白基因克隆、表达产物对ABA的特异结合.pdfVIP

中文摘要 脱落酸(abseisie acid，ABA)作为一种植物激素，已证实不仅在调控植物体眠、衰老和果实发 育等诸多过程中起着重要的调节作用．而且，在植物对干旱、低温、盐碱等逆境胁迫的反应中起着 共同调节因子的作用。在ABA到达作用位点后，ABA应答反应的第一步是一系列的细胞信号感知 和识剐，其中，ABA受体对原初信号的识剐起着关键的作用。利用ABA类似物能够激活不同的应 答途径，推测在植物不同的组织结构中存在多种的ABA受体。尽管，通过遗传学、生物化学、细 胞生物学方法，ABA结合蛋白的研究取得了巨大的进展。但是，遗憾的是至今仍然还未鉴定出任何 可能的ABA受体。因此，真正意义上的ABA受体确定仍待做大量的工作。 近年来，我宣利用亲和层析从蚕豆下表皮中分离出一种高亲合、高度特异性的ABA结合蛋白， 并完成了对其生化特性深入分析及部分测序，且在一定程度上揭示了该蛋白与ABA的生理功能效 应存在着内在的联系，这为进一步克隆ABA结合蛋白基因奠定了坚实的工作基础。本研究是在此 基础上以基于测序的部分氮基酸序列设计的简并寡核苷酸为扩增引物．结合RT-PCR和RACE技术 从蚕豆幼叶中克隆得到了两个全长eDNA序列，并建立了该基因甲醇酵母高效表达体系，通过 ProBond resin镶亲和层析一次可纯化出毫克级表达蛋白，为ABA结合蛋白生理功能的进一步鉴定 迈出了坚实的一步。 37-／5 中5’非翻译区为876个核苷酸，3 7非翻译区为369个核苷酸并末端带Poly(A)尾巴，从起始密码子 7j#翻译区为8s个核苷酸，37非翻译区为144个核苷酸并 片段的全长cDNA为1012核苷酸，其中5 放阅读框架(780bp)。 a上，使之位于a因子信 利用PCR技术将上述两个全长eDNA的编码区克隆到表达载体pMET 号肽序列的下游，6个组氨酸残基序列的上游，且与之同框，分别构建成融合蛋白分泌表达载体 a A／ABP780。通过LiCI化学转化法将构建的重组质粒插入到甲醇酵母 DMET B／ABP2304和pMETa SDS．PAGE检测结果表明：选出的重组高效表达菌株蹦ADl6／pMETa a 10％，经过ProBondResin镲亲和层析柱都得到了纯化，其纯度都在90％以上，一次纯化分别可褥到 结合法实验结果表明，75kD纯化蛋白显示出较高的特异结合活性，55kD纯化蛋白无显著的特异结 合话性。 。 关键词：脱落酸结合蛋白，简并引物，RACE，酵母表达系统，亲和层析 Abstract Abscisic asa hormone，not of acid(ABA)actsplant only manyimportantaspects regulates plant and and fruit alsomediates dormancy,,senescence some growthdevelopment，including development，but toenvironmentalstressesas of such arrival andsalt．Afterat aspects