制备炭疽芽胞杆菌检测基因芯片的初步与研究.pdfVIP

英文缩写词表 摘 要 anthracls)是可形成芽胞的革兰式阳性 炭疽芽胞杆菌(Bacillus 需氧菌，可导致炭疽疾病。炭疽是草食动物的一种主要疾病，人类接触 土壤中、皮毛上的炭疽杆菌芽胞可以导致感染。芽胞可以通过呼吸道、 消化道和皮肤接触感染人类，以皮肤型炭疽最常见。由于炭疽芽胞在环 境中的抵抗力极强，有可能为生物恐怖分子所利用而造成社会动荡。2001 年美国出现的炭疽杆菌芽胞生物恐怖事件也说明了该菌芽胞的威胁性。 无论是生物战的使用，还是作为生物恐怖手段，快速检验和鉴定炭疽芽 胞杆菌是最关键的。最近发展迅速的生物高新技术——基因芯片技术为 炭疸芽胞杆菌的鉴别诊断提供了一种快速、高效、敏感、经济、自动化 的方法。 本研究以炭疽芽胞杆菌的毒素质粒pXOl和荚膜质粒pX02为原材料， 根据6enBank中两个质粒的特异性基因序列信息，设计引物并扩增了质 cya和pX02上的特异性基因CapB。 粒DXOI上的特异性基因pagA、Ief 分别以炭疽芽胞杆菌的毒素质粒pXOl和荚膜质粒pX02以及其上的特异 性基因为原材料，使用限制性内切酶Sau3AI酶切质粒pX01和pX02及特 异性基因，酶切片段经TaqDNA聚合酶72℃补平加A，并与T载体连接， 后转化感受态细胞。一次PCR初步鉴定并筛选出炭疽芽胞杆菌DNA片段 的阳性克隆。采用牙签插胶的方法回收一次PCR产物并以此为模板进行 二次PCR扩增，以减少探针所包括冗余的T载体序列，制备纯净的炭疽 芽胞杆菌基因芯片探针。实验中共收集了294个阳性克隆探针，并打印 在经过氨基化修饰的玻片上，制成炭疽芽胞杆菌DNA芯片。 此外，根据炭疽芽胞杆菌毒素质粒pX01和荚膜质粒pX02的基因序 列信息，并按照寡核苷酸探针设计原则设计了检测炭疽芽胞杆菌的60met 寡核苷酸特异性探针，并使用DMSO作为点样液，将20条60mer特异性 寡核苷酸探针打印在经过多聚赖氨酸包被的DAKO硅烷化玻片上，制成检 测炭疽芽胞杆菌的寡核苷酸基因芯片。 分别提取苏云金(Bacillus 制性显示技术标记细菌、正常人血液总DNA及炭疽芽胞杆菌的两个质粒 DNA并与炭疽芽胞杆菌DNA芯片进行了杂交反应，扫描并分析各探针的 荧光强度。实验中对所制备的DNA芯片检测炭疽芽胞杆菌的实验条件做 进一步优化。实验结果显示：基因芯片技术可以有效地检验出炭疽质粒 的DNA序列成分。采用限制性显示标记技术进行样品的标记，可提高芯 片杂交信号：在荧光标记后的样品内加入EDTA，也是一种提高芯片信噪 比的方法；此外，在高严谨性的条件下(高温，低盐离子浓度、短时间) 杂交可提高芯片检测的特异性。 关键诃：炭疽芽胞杆菌；基因芯片；寡核苷酸芯片：毒素质粒pX01：荚 膜质粒pX02 4 ABSTRACT the Anthraxisabaeterialdiseasecaused by spore—ferming is Bacillus bacterium．It apthracYaGram—positive，rod—shaped anthrax a andhumanscancontract diseaseofherbivotes primarilY from animalsorfrom or infected directly indirectly