中药滇黄芩的遗传操作.pdf

摘要 amoena 演黄芩(Scutellaria C．H．wright)为唇形科黄芩属多年生草本植物，其黄芩 苷和黄芩素含量均高于黄芩。作为黄芩的替代品，广泛应用在我国西南地区。目前滇黄 芩野生植物资源由于过度开采遭到破坏；而其种子成熟不一致，直播后出苗不齐，也未 能开展大规模人工种植。本研究以滇黄芩为材料，建立了器官发生离体培养体系，毛状 根转化和再生体系并克隆了滇黄芩黄酮类合成中关键酶UBGAT基因，为滇黄芩遗传育 种操作以及扩大药材资源提供实验基础。具体研究结果如下： (1)以滇黄芩不带腋芽茎段为外植体，采用不同配比激素的MS培养基建立了滇黄芩 2 4-NAA0．5 器官发生，植株再生体系。结果表明，茎段在MS+6-BAmg／L mg／L培养基 4-6-BA2 上培养时，愈伤组织诱导率达到100％；以相同培养基进行分化，并在MS mg／L+ NAA0．2 Ms+IBA0．2 mg／L培养基上扩繁丛生芽。在l／2 mg／L培养基诱导生根，扦插继 代。 用RAPD分子标记方法，分析了滇黄芩通过器官发生途径获得的再生植株可能的遗 传变异。不同茎段的再生植株随机选取1条引物进行RAPD扩增，结果显示8株植株扩增 出的条带具有高度的一致性。扩增不同继代次数的再生植株DNA，所用的39条随机引物 中只有1条引物带型发生变化。以上结果说明经器官发生途径获得的再生植株遗传稳定， 可多次继代培养。 (2)应用5％NaOH染色的植物组织化学定位方法，研究了滇黄芩再生植株中黄酮 类化合物的积累分布，发现黄酮类化合物主要存在于再生植株营养器官的表皮和皮层， 以及茎、叶腺毛中；并且通过HPLC对滇黄芩再生植株中黄芩苷的含量进行测定，其中 滇黄芩根的黄芩苷含量为O．12％，茎的黄芩苷含量为0．34％，叶的黄芩苷含量为0．55％。 (3)利用发根农杆菌1．2556感染滇黄芩再生植株的茎段和叶片，建立了毛状根培养 体系。经rol—B基因PCR检测和冠瘿碱检测表明黜质粒已整合入滇黄芩毛状根基因组 中并表达。获得的毛状根系经HPLC方法都能检测到黄芩苷合成，其中1个毛状根转化 系黄芩苷含量为2．59％，以3年单位时间黄芩苷生成量计算，是药材黄芩的7．18倍。毛 2 0．2 状根在附加6-BA mg儿和NAAmg／L的MS固体培养基上直接诱导不定芽，并在 MS培养基上生根，形成再生转化株系。 32a中，表 与报道的黄芩UBGAT具有99．O％同源性。序列亚克隆到原核表达载体pET 达产生56Kd蛋白带。 关键词：滇黄芩；器官发生途径；遗传稳定；RAPD；毛状根；组织化学定位；HPLC； 黄芩苷；黄酮类物质，UBGAT Genetic ofScutellariaamoena manipulation C．H．Wright Abstract Scutellariaamoena a herbaceousnativetoSouthwestof C．H．Wright,isperennial plant ithas been studied、历m as China．Recentlywidely pharmacologicalactivityanalysis鹤well clinicaltestsduetoits contentsofbaicalinandbai