固氮酶铁蛋白nifH基因在高等模式植物烟草叶绿体中表达分析.pdf

摘 要 氮是地球上一切生命有机体的必需元素．大气中含有充足的氮源却不能直接被植物吸收利 H|，农作物要靠施_lI』人鼙化肥才能满足正常生长对氮的需求。如果能使高等植物也像同氨微生 物那样能够进行自身阁氮．无疑具有十分重大的理论和实践意义。 本研究利用叶绿体员．有的与固氨基因相似的原核特性及其它有利因素，提出在叶绿体中表达 州氮基因的没想，并尝试将固氮酶铁蛋白柚啊基因导入到高等模式植物烟草的川‘绿体中．研究 其在叶绿体环境中表达的可行性，从而为这一新设想的最终实现作一些先期探索性一l：作。 本论文主要包括两个部分 一、单子叶植物水稻叶绿体psbA基因启动子和终止子的克隆及功能验证 俐用分子生物学方法从水稻叶绿体基因组文库中克隆了水稻叶绿体psbA基因启动予和3’终 止爿静乩与GUS融合后构建成转化载体pRG6。以该质粒分别转化大肠杆菌和双于时植物烟草 buffer 反应生成监色沉淀：对照菌体则未产生任何可见的颜色变化。仍呈淡黄色．说明肿鲥启动子可 以在大肠杆菌中行使正常的起始转录功能． 被转化的烟草叶片经过3天灼染色后；在显徼镜下观察到叶片细胞内部出现了许多小的篮 色沉淀区域，其大小和形状均与叶绿体所具有的特征相符台．而正对照核质表达载体pBll2l转 化叶片．在经过24h的染色后，可以观察刭一些细胞有明显的蓝色反应，其GUS基羽的表达产 物与X-Glue反应所形成的蓝色沉淀基本上均匀地分布于被转化细胞的整个细胞质中，有时蓝色 沉淀还会扩敬到相邻细胞中。这说明水稻pxbA启动子与CaMV35S核质启动子具有完全不同的 性质，它只能驱动外源基因在叶绿体中表达。本实验不仅证明所克隆的脚4启动子片段是有功 二、固氮酶铁蛋白．ifH基因在叶绿体中的表达及抗性基因在叶绿体转基因植株后代 中的遗传规律 3．2kb的同源片段，其中含有 ＼通过对烟草nl绿体基因组全序列资料进行分析，选择了一段K 位点既本处丁基冈的编码序列区中，也不在编码愿以外的基因表达调控元件上，冈此适r作为 外源基冈的插入付点。 nl绿体转化及表达载体pTRCH205。基冈枪法转化烟草叶片。经壮观霉素筛选获得转化弭生植 株。 将再生植株的州片进一步切割成小块，在含有壮观霉索的选择分化培养基上进行多轮次的 筛选，使转化叶绿体在选择乐r逐渐取代朱被转化的野生型叶绿体，从而达剑同质体化。 株中，有5株扩增出了O．8kb的∞枷基闪。说明抗性基冈在这些植株的体内得到了格合。兄一 株PCR阴性植株之所以在含有高浓度壮观霉紊的培养墓中能够正常生K．可能是由1：在转化过 张巾，”l绿体毖冈产·生了突变，从而产生{L观霉素抗性。 根据I卟绿体f·d’源片段l外漩基圳插入位点两侧的序列殴计合成一对PCR引物．心该引物分 别对经过一轮次和多轮次抗性筛选所得植株的叶绿体DNA进行扩增。结果，～轮次筛选植株 均能扩增山两个条带。其大小分别与野生型叶绿体和转化叶绿体的同源片段上两引物问的距离 相符合，而多轮次筛选植株只扩增出一个条带，其大小与前述较人的DNA条带相一致。这说 明转化后经过首轮抗性筛选所得转化子均为嵌合体，只有经过多次筛选后才能达剑完全同质化。 这也从兄一方面证明，外源基因确已整合进入了叶绿体基因组中。 其产物NIFH的分子量人小与标准印铁蛋向分子鼙完全相同。这是同氮酶n∥Ⅳ基冈在高等植 物Hlt绿体中直接成功表达的首次报道。 ． ／ 7 种f萌发试验结果证明，抗性基因在叶绿体转基冈植株后代中遵循单亲母系遗传规律。J 、 ／ ／ ／ ， 系遗传 Abstract ThisPh．Ddissertationconsistsoftwoofwork mainly parts 1．T