第六章 目的重组子的筛选与鉴定.pptVIP

阳性重组子的筛选和鉴定（检） 不同检测方法可以归类于以下三个层次： 载体遗传标记检测 克隆DNA序列检测 外源基因表达产物检测 一、根据遗传表型筛选 1．抗生素平板筛选 大多数克隆载体均带有抗生素抗性基因，常见的有抗氨苄青霉素基因(Ampr)、抗四环素基因(Tetr)、抗卡那霉素基因(Kanr)等。如果外源DNA片段插入载体的位点在抗药性基因之外，不导致抗药性基因的插入失活，仍能编码抗药性基因，这种含有重组子的转化细胞能够在含有相应药物的琼脂平板上生长成菌落。 但是除阳性重组子以外．自身环化的载体、未酶解完全的载体以及非目的基因插入载体形成的重组子均能转化细胞而能生长，故本法仅是阳性重组子的初步筛选。 同样还可应用插入失活双抗生素对照筛选法，在含有两个抗药性基因的载体中，通过插入失活其中一个基因，可用两个分别含有同药物的平板对照筛选阳性重组子。如pBR322质粒含有Tetr、Ampr双抗药性，插入失活Tetr后，Tet r 、Ampr为含载体的阴性菌落，Tet - 、Ampr表型的菌落为阳性，Tet - 、Amp - 的表型不能生长，对未转化的受体细胞，该方法筛选出阳性重组子的几率较高(Tetr：四环素抗性；Ampr：氨苄毒霉素抗性，Tet - ：对四环素敏感；Amp - ：对氨苄青霉素敏感) 2．?互补筛选 利用?-半乳糖苷酶基因构建的载体如pUC系列的质粒常采用?互补筛选。?-半乳糖苷酶 (?-galactosidase)是一种把乳糖分解成葡萄糖和半乳搪的酶，最常用的?-半乳糖酶基因来自大肠杆菌的Lac操纵子，它们使载体中带有大肠杆菌Lac操纵子的调节序列和编码?-半乳糖苷酶N末端146个氨基酶的序列。用异丙基-?-D-?硫代半乳糖苷(IPTG)可诱导这个氨基末端片段的合成，合成的片段能与宿主编码的?-半乳糖苷酶缺陷型进行基因内互补，恢复该酶的活性，这一过程称?-互补。 因此当载体带有LacZ调节序列和编码?半乳糖苷酸N末端146个氨基酸的序列，而宿主中该部分序列缺陷、其他部分完整时，虽然宿主编码的或质粒编码的片段本身都没有活性，但它们互相协助则可在大肠杆菌内形成一个具有酶活性的蛋白质。故在诱导物IPTG存在下，细菌在含生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-?-D-半乳糖苷(X-gal)培养基的平板上可形成蓝色菌落。当在质粒多克隆位点中插入外源DNA时，可使?-半乳糖苷酶的氨基末端失活，从而不能进行?互补，因此带有重组质粒的细菌产生白色菌落。 3．插入表达筛选 4．噬菌斑筛选 二、应用限制性内切酶酶切分析筛选 所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本也高。 三、核酸探针筛选 四、PCR筛选 PCR技术具有高度的灵敏度和特异性，能在极短的时间内将目的基因扩增至数百万倍，通过电泳，可直接观察到产物的存在。 ? 五、菌落原位杂交技术 * 第六章 阳性重组子的筛选和鉴定（检） 由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子。 转化子 重组子 目的重组子 一、根据遗传表型筛选 二、应用限制性内切酶酶切分析筛选 三、核酸探针筛选 四、PCR筛选 五、菌落原位杂交技术 1．抗生素平板筛选 2．?互补筛选 3．插入表达筛选 4．噬菌斑筛选 Ampicillin resistant? yes yes Tetracycline resistant? No yes B X B B B X Ampr ori Ampr Tcr ori pBR322 Ampr Tcr ori Screening by insertional inactivation of a resistance gene Replica plating: transfer of the colonies from one plate to another using absorbent pad or Velvet (绒布). transfer of colonies +ampicillin + ampicillin + tetracycline these colonies have bacteria with recombinant plasmid 蓝白筛选 有些载体设计时，在筛选标志基因前面连接