柞蚕热激蛋白9基因的克隆与表达分析.pdf

捅 要 柞蚕是一种具有重要经济价值的野生绢丝昆虫，属于鳞翅目、大蚕蛾科、柞蚕属。 柞蚕茧可作为纺织工业原料使用，其幼虫和蛹还具有重要的药用和食用价值。尽管昆 虫在高温和低温等不利环境下的生活史对策已有较多研究报道，但柞蚕对于高温耐受 shock 性的生化与分子机制仍未被解析。热激蛋白(heat proteinHsp)是一种抗逆蛋 白，在细胞受到胁迫时表达量会增加，对细胞起到一种保护作用，帮助生物机体度过 不利环境条件。近期的研究还表明，HSPs还与生物的生长、发育与分化、细胞内信 号传导和育性转化有关。本论文在克隆获得柞蚕热激蛋白90(凰渺9D)基因序列的基 础上，进一步对蛹在不同温度胁迫下的相对表达量进行了测定，并且大肠杆菌内进行 了成功的表达，从而为阐明柞蚕耐高温的分子机制提供参考。主要结果如下： 1．柞蚕月劝9D克隆及序列分析： 如基因cDNA全长序列。柞蚕H驴夕D基因cDNA全长序列序列全长2482bp，开 放阅读框长2154 bp，编码717个氨基酸。预测的该蛋白的相对分子量和等电点分别 为82．6 l(Da和5．0。该序列具有月印如家族的典型特征和特殊的功能结构域，并且 与多种生物的却如核苷酸序列以及推导的氨基酸序列都具有较高的同源性。系统 进化分析表明，柞蚕脚如和天蚕的却如氨基酸同源性最高，为94．5％。 2．高温胁迫下柞蚕体内却如基因表达量的变化 提取柞蚕幼虫及蛹期的不同组织的I埘A，反转录为第一链cDNA进行半定量 RT-PCR。实验结果表明，衄咿如在精巢中的表达量较高，而其他被检组织中的表达 量无明显差异。 利用18S rI矾A作为内参基因，以柞蚕不同组织的I斟A为模板，结合实时荧光 定量PCR(SBGY min后柞 蚕蛹期体内脚90基因相对表达量。结果表明，脚9D基因表达量随着温度升高呈 增加的趋势。42℃胁迫下，不同组织内的脚90基因表达量均高于对照的(PO．05)。 脚90基因较高的表达水平说明这种蛋白在柞蚕抗高温中起到一定的保护作用。 3．脚90基因的原核表达 泳和蛋白纯化检测，目的蛋白得到了稳定的表达。 关键词：柞蚕，热激蛋白90，克隆，实时荧光定量PCR，原核表达 Abstract isakindof to insect，which 彳，2历P，．口P口pPr，纱f deVeoping、访ldilk—proi【ucing bIongs a11dedible haS omcinal good 上印f却胞，．口勋f“聊f玉妇P么，z砌P阳P口．彳，2砌P，．口P口per砂f economicalvalues for in asrawmaterials．Oakcocoonto industry exc印tutilizingspi血ng oftextile t11e aJsohave medicinalValue mal【euseofmwmat嘶al industrial，aIldpupa lligh in toc01dand andedible 7D n则AleVels