表达载体的构建2.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２９（８）：９２～９６ 檪檪檪檪檪檪檪檪殏 檪 殏 殏檪檪 研究简报殏檪 檪檪檪檪檪檪檪檪 甘蔗茎秆特异表达基因启动子的克隆及初步分析 蔡文伟　王正鹏　张树珍　杨本鹏 （中国热带农业科学院热带生物技术研究所　海口　５７１１０１） 摘要　甘蔗茎秆是利用转基因方法生产重组药用蛋白或有价值的化合物的理想器官，构建能在 甘蔗茎秆中高水平表达异源蛋白质的表达载体是非常有意义的。而一个高效表达的载体，启动 子则是其最重要元件之一，因此，茎秆特异性启动子的获得是甘蔗作为生物反应器的前提。利用 染色体步移法克隆到甘蔗己糖转运蛋白基因ＰＳＴ２ａ５′端上游的一段长１９６８ｂｐ的序列（Ｐ ），经 ｐｓｔ２ａ 序列测定及软件分析表明，该序列具有典型的启动子结构。此序列置换植物表达载体 ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１上的ＣａＭＶ３５Ｓ启动子，构建植物表达载体，命名为ｐＣＡＭＢＩＡ１９００，该启动子下游 为ｇｕｓ基因。利用基因枪法转化甘蔗的茎和叶，对ｇｕｓ基因的瞬时表达进行测定，结果表明所获 得的己糖转运蛋白基因启动子只在甘蔗茎中驱动ｇｕｓ基因瞬时表达，该启动子具有茎秆特异性。 关键词　甘蔗　启动子　茎秆特异表达 中图分类号　Ｑ７８５ 　　甘蔗是禾本科（Ｇｒａｍｉｎａｃｅａｅ）甘蔗属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ 启动子很可能是甘蔗茎秆特异高效表达启动子。本研 Ｌ．）植物，原产于热带、亚热带地区。甘蔗具有光合效 究的目的是克隆ＰＳＴ２ａ基因５′端上游的启动子序列， 率高、生物量大、宿根性好、容易种植，易于转化、转基 通过构建携带ｇｕｓ基因的植物融合表达载体，转化甘蔗 因安全性好等特点，国外已把其作为生物反应器生产 不同组织以检测启动子特性，以期获得能应用于甘蔗 防腐剂、药用蛋白和可降解塑料［１，２］。外源基因能够在 生物反应器研究的茎秆特异表达启动子。 植物组织中实现正常乃至高效的表达，一个重要的条 １　材料与方法 件是构建一个高水平表达异源蛋白质的表达载体，而 一个高效表达的载体，启动子则是最重要元件之一。 １．１　材　料 组织特异性启动子能使外源基因在转基因植物中特定 １．１．１　实验材料　甘蔗为新台糖２２号，采自热带作物 时间、特定组织表达，使目的基因的表达产物集中、并 生物技术国家重点实验室实验基地。 ＴＭ 且表达量增加。因此，茎秆特异性启动子的获得对于 １．１．２　试剂　ＬＡＰＣＲ ｉｎｖｉｔｒｏＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ和ＰＭＤ１８ 甘蔗作为生物反应器的研究具有重要的意义。 Ｔｖｅｃｔｏｒ购自ＴａＫａＲａ公司，其它试剂购自华美公司。 ［３］ １．２　方　法 　　Ｃａｓｕ等 报道了甘蔗的一个编码己糖转运蛋白的 基因ＰＳＴ２ａ（登录号：ＡＹ１６５５９９），并通过实验证明该基 １．２．１　已糖转运蛋白基因启动子的分离　（１）甘蔗基 因在成熟茎中大量表达，且定位于韧皮部伴胞细胞和 因组ＤＮＡ的提取　甘蔗基因组ＤＮＡ的提取采用改良 ［４］ 维管束薄壁组织中特异表达。据此我们认为该基因的 的ＣＴＡＢ方法 。 　　（２）甘蔗已糖转运蛋白基因启动子扩增　准备５ 收稿日期：２００９０１０４　　修回日期：２００９０５１３ 个０．５ｍｌ无菌离心管，每管放入５ｇ甘