6目的基因的制备与分离.pptVIP

目的基因的制备与分离 5）转座子（转座基因） 能改变自身座位的一段核苷酸顺序。可含有一个或几个基因。通过转座，生物的遗传信息会改变 …… …… 1、目的基因的直接分离法 （六）功能蛋白组技术分离目的基因 蛋白质双向电泳（分离蛋白） 目的蛋白做抗原，制备抗体筛选表达文库或测定氨基酸序列合成DNA探针筛选文库（或PCR扩增目的基因） OVER 目的基因的制备与分离方法总结 直接分离法 基因组文库法 cDNA文库法 PCR扩增法 图位克隆法 …… 优点：a）合成cDNA的效率高 b）直接利用第一链的反应产物，不需纯化 c）避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA 需要3种酶：RNA酶H 、大肠杆菌 DNA聚合酶Ⅰ和DNA连接酶 置换合成法 3、引导合成法： 获得的双链cDNA 能保留完整的5’端序列 基因组DNA文库与cDNA文库的比较 mRNA减法杂交 分离T细胞受体基因 目的基因不表达的B细胞 表达目的基因的T细胞 B细胞和T细胞都表达mRNA T细胞 特异表达的mRNA B细胞的mRNA(含有polyA) T细胞反转录得到的cDNA 杂交 仍旧是 单链的cDNA mRNA差别显示技术 （差别显示反转录PCR） 基本流程 染色体步移法克隆目的基因的基本流程 未知基因 已知基因 基因组文库克隆片段 A B C D E F X Y 间隔100bp 酵母双杂交体系原理 3）双抗体免疫法分离编码蛋白的基因 适于真核蛋白已分离纯化 。核糖体+ mRNA 多核糖体+核蛋白抗体 孵育，形成复合体 +二抗 不连续蔗糖梯度离心 分离出含待定mRNA的多核糖体 酚、氯仿抽提，柱层析分离出含特定编码蛋白的mRNA 反转录目的c DNA 改进：SPA替代二抗发展出SPA-Sepharose 4B亲和柱介质分离更有效 4）利用酶促反转录法直接从特定mRNA分离基因 反转录酶 聚合酶 mRNA cDNA dscDNA 2、构建基因组文库分离法 （4）构建柯斯质粒基因组文库 优: 比λ噬菌体容纳的外源DNA大(30～45kb),构建完整文库所需克隆数少; 载体仅约5kb,可直接分析插入片段的限制性图谱,而λ噬菌体则否. 缺点 : 难筛选;重组效率低(105～6～104～5clongs/μgDNA);不易储存. 基因组文库的构建过程:酶解制备外源DNA;酶切载体;连接重组并包装进噬菌体;重组体转染宿主菌。 （5）构建YAC基因组文库 以质粒pBR322为骨架,保留复制位点ori和筛选标记Ampr,并加入酵母染色体必需的五个组件而构建YAC载体.常用p YAC4构建文库. EcoRI+BamHI 双酶切 p YAC4; 制备生物体完整基因组并片段化; 连接转化。 用柯斯质粒载体 构建基因组文库 克隆进柯斯质粒载体 YAC(酵母人工染色体）用于基因组文库的构建 2）cDNA文库的构建 分离细胞总RNA 以mRNA 为模板，合成cDNA 第一链 cDNA第二链的合成（自身引导合成法、置换合成法、引导合成法、引物－衔接头合成法） 常用方法:1、 2 、 3、 4、5、 6、 将合成的双链DNA重组入载体，导入宿主(大肠杆菌)增殖 3）mRNA的丰度与cDNA基因文库大小的关系 要获得高丰度的某mRNA, 必须选好适当的材料. 文库中c DNA的克隆数=细胞总mRNA数/细胞中某种mRNA的拷贝数 实际需构建的最小值远超过公式理论值, 可按下面公式估算 N=ln( 1-P ) / ln( 1-f ) N： c DNA基因文库必需的克隆数 P：文库中含目的基因c DNA片段的出现概率 f：某mRNA 的丰度 / 总mRNA数的比值 4）cDNA基因文库法分离目的基因的优缺点 4、载体引导法合成全长双链cDNA 5、固相支持物法合成全长双链cDNA 使用λgt10噬菌体载体构建cDNA文库 4）c DNA克隆的优越性和局限性 根据前估算公式, 提高目的基因mRNA在总数的比例可减少c DNA文库的克隆子数,构建前用各种方法富集和提高目的mRNA丰度,可降低文库的复杂性和分离难度. cDNA和基因组文库构建方法比较 与基因组文库相比,在构建和基